从羊膜中提取Lumican及其储存温度的测定

该方法旨在展示一种简单的蛋白质提取技术，可用于获得丰富的蛋白质和其他因素。该技术可用于提取羊膜中存在的其他因子和蛋白质，也可以从其他来源（例如动物和植物组织）获得蛋白质。首先解冻从羊膜库获得的100毫克羊膜。

解冻后，将10毫升无菌平衡盐溶液加入培养皿中，并洗涤膜两分钟。然后，将用过的平衡盐溶液放入烧杯中并重复该过程，直到培养皿中看不到甘油培养基的痕迹。接下来，向膜中加入10毫升分散酶II，并在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育30分钟。

在孵育结束时，用橡胶警察细胞刮刀进行机械去上皮化。然后，在倒置显微镜下观察膜以确认去上皮化。接下来，如前所述，用无菌平衡盐溶液洗涤去上皮化的羊膜，并将其放入两毫升微量离心管中。

然后，将装有膜的管浸入液氮中40分钟。用液氮冷冻后，在研钵中手动研磨膜两到三分钟，在零下85摄氏度下预冷，直到得到细粉。接下来，加入2.5毫升蛋白酶抑制剂溶液并溶解细粉状膜。

在手术刀的帮助下清洁砂浆壁，并将混合物转移到五毫升的管中。涡旋试管30秒。然后，首先在4摄氏度下以34 G离心20分钟，然后立即在4摄氏度下以3， 360 G再次离心20分钟，使组织混合物均质化。

在离心结束时，将上清液（即羊膜提取物）收集在新管中。然后，在不同的两毫升微量离心管中等分 0.7 毫升，用于不同的时间点和温度。羊膜提取物中的总蛋白量和发光聚糖浓度受时间和贮藏条件的影响。

所有羊膜提取物的基础蛋白浓度相似。然而，在4摄氏度下储存32天和在零下20摄氏度下储存20天的提取物中注意到显着高的蛋白质浓度。羊膜提取物中的Lumican在储存12天的样品中明显高于在4摄氏度和零下20摄氏度下储存30天、20天和6天的样品。

这些结果表明，在零下20摄氏度下，达到夜光聚糖最高浓度的适当储存时间和温度为12天。在将冷冻羊膜接地时要格外小心。接地应轻柔，因为它可能会从砂浆中掉出来。

需要进一步的研究来确定羊膜提取物lumican在角膜上皮细胞中的作用，并确定Lumican用于角膜再上皮化的理想剂量。