改进小鼠噪声性听力损失的实验条件及听力功能和外毛细胞损伤的评估

尽管已经有关于噪音引起的听力损失的研究，但没有一个如此详细地记录该方法，使其成为一个重要的程序。该方法有效地引起小鼠噪声引起的听力损失，并通过ABR观察听力阈值的实际变化。噪声性听力损失的动物模型有助于科学家彻底了解噪声性听力损失的机制，进而优化相应的治疗策略。

演示该程序的将是Dian-Shiue Lee，他是我实验室的一位非常有才华的学生。为了准备实验小鼠的笼子，使用捕鼠笼并将四块瓦楞塑料板切成适当的尺寸，使它们适合笼子。为了防止小鼠的脚被网状网格割伤，请分别将其中两块放在底部和背面。

将另外两块垂直互锁放置，将笼子内的空间分成四等份 打开CLIO应用软件。将光标移动到扬声器图标上，然后单击 TwoSin。输入频率 1 到 1， 000 赫兹，频率 2 到 6， 000 赫兹的值并更改，然后单击"确定"开始播放声音。

在 Leq 选项卡下，将 dBV 更改为 dBSPL。在软件界面上设置时间后，单击绿色三角形按钮播放声音。将麦克风放在扬声器前面，距离 8.5 厘米，以校准噪音水平。

将噪音水平调整为125分贝SPL-A，并连续监测至少三分钟，以确保噪音水平足够稳定。使用发生器、分析仪和放大器来产生和控制噪声。将四只雄性C57黑色6J小鼠放入笼中，每季度一只，以进行噪声暴露。

在噪声暴露期间将小鼠随机分配到每个季度。将麦克风放在笼子的顶部，以监测噪声暴露期间的噪音水平。将扬声器前面的支架放在隔音盒内，确保扬声器距离支架 8.5 厘米。

将小鼠暴露在一千赫兹和六千赫兹频率的噪音中，每天连续六小时，连续五天。通过测量ABR在第6天和第13天测量小鼠的听力阈值。 使用专为小动物设计的商业ABR测试系统进行ABR测量，并保持动物处于全身麻醉状态。

将 12 毫米皮下针电极放在左耳耳廓后面的顶点，并靠近尾巴，以测量听力阈值。将扬声器放置在距离动物左耳一厘米的地方后，使用扬声器呈现声音刺激。选择正弦波作为刺激，选择10 k作为窗口刻度。

转动频率旋钮以获得所需的声音刺激频率。通过转动函数发生器上的 AMLP 旋钮来调整刺激强度。通过将AMLP旋钮旋转到通过校准计算的合适电压来获得所需的激励强度。

在一系列刺激强度（从 10 到 100 分贝 SPL）下收集 ABR 测量值，步长为 10 分贝。将可能产生可识别的 V 波的最低刺激强度水平标记为 ABR 阈值。ABR测量后处死小鼠，并从安乐死小鼠中收获耳蜗。

收获组织后立即将它们浸入10%甲醛中进行固定，并让它们在四摄氏度下休息至少八个小时。如文中所述，使用 EDTA 进行脱钙。将耳蜗放入装满PBS的培养皿中。

对于组织染色，将Corti或OC的螺旋形器官切成三个部分:基底转，中转和顶转。在放大倍率为 8 倍至 35 倍的解剖显微镜下，去除骨结构，包括前庭鳞片、鼓室鳞片和脱钙耳蜗的修饰，并获得软组织，包括 OC。在噪声暴露一天后，在 12 千赫兹、24 千赫兹和 32 千赫兹观察到听力阈值显着增加。部分听力恢复发生在噪声暴露一周后，但与对照组相比，所有频率的听力阈值仍升高了30分贝以上。

在这项研究中，听力在高频下受损更大。在第6天和第13天，对照组和实验组之间的听力阈值均存在显着差异，分别为12千赫兹和32千赫兹。与对照小鼠相比，在从NIHL小鼠获得的显微图像中始终观察到外毛细胞的丢失。

虽然内毛细胞在所有图像中都保持完整，但OC基底和中转的外毛细胞严重受损。相比之下，顶端转弯的外毛细胞几乎完好无损。该协议中最重要的步骤包括噪声暴露，ABI测量，收集耳蜗。

该程序可用于通过使用各种类型的声音来研究不同频率的噪声暴露对听力损失的影响。