使用单蠕虫数据量化 秀丽隐杆线虫的异质性 - 细菌相互作用

该协议展示了秀丽隐杆线虫的机械破坏。采用 96 孔格式，允许中等通量定量单个蠕虫中的细菌负荷。与基于 Pasel 的方法相比，该技术提高了机械破碎的速度和均匀性，使研究人员能够轻松生成更大的高质量单蜗杆测量数据集。

这种技术涉及许多活动部件，很容易失去您的位置。在开始之前，请确保已设置所有材料、标记的试管、缓冲液和板。演示该程序的将是我实验室的研究专家梅根泰勒。

首先将蠕虫样品重新悬浮在微量离心管中的一毫升M nine TX zero one中。通过离心收集成虫并弃去上清液。使用相同的离心参数。

用一毫升M9TX01冲洗蠕虫两次，用一毫升M9蠕虫缓冲液冲洗一次，以尽量减少外部细菌。然后，将每个样品重新悬浮在一毫升S培养基中，并在培养管中将两个x热杀死OP50。将试管在 25 摄氏度下孵育 20 至 30 分钟，以使非 AD 粘附的细菌从肠道中排出。

孵育后，用一毫升冷M9TX01冲洗吹扫的蠕虫两次，并丢弃超级清液。将试管放在冰上 10 分钟以麻痹蠕虫。然后在每个试管中加入一毫升冰冷的 M nine 蠕虫缓冲液和无味漂白剂。

将试管在冰上孵育至少 10 分钟以杀死外部细菌。丢弃漂白缓冲液并将管子放回冰中以防止蠕虫泵送。接下来，向每个试管中加入一毫升冷的M9TX01并离心五秒钟。

在小型离心机中。将试管放回冰上并除去上清液。重复此步骤一次。

用于蠕虫角质层的化学透化。将含有蠕虫的管在20微升缓冲液中转移到室温管架中。然后向每个温热的样品中加入100微升SDS / DTT溶液。

将试管在工作台上孵育长达八分钟，以部分分解成虫的角质层。此时，蠕虫将死亡并沉淀在管子底部。孵育后，小心地弃去SDS / DTT上清液。

然后，向每个试管中加入一毫升M9TX01，并短暂离心以沉淀蠕虫。弃去上清液，将蠕虫重新悬浮在含有0.1%Triton x-100的1毫升M九蠕虫缓冲液中。为了准备蠕虫的机械破碎，请获得无菌的两毫升深井96孔板和硅胶板盖。

使用无菌勺刮刀向每个孔添加少量无菌36网格碳化硅，使网格几乎覆盖孔底部。向每个孔中加入180微升M nine蠕虫缓冲液。标记列和行，然后用硅胶板盖松散地覆盖板。

接下来，将透化的蠕虫转移到一个小培养皿中，将M9TX01填充到一厘米的深度。使用解剖显微镜移液出20微升体积的单个蠕虫，并将它们转移到96孔板的各个孔中以弹出粘在移液器上的任何蠕虫，从培养皿的透明区域吸出20微升M9TX01并将其释放回培养皿中。转移所有蠕虫后，用一张柔性天花板膜覆盖 96 孔板，纸背面朝下放在样品孔上。

将硅胶天花板垫轻轻放在柔性天花板膜的顶部，不要将盖子向下压入井中。将板在 4 摄氏度下放置 30 到 60 分钟，以防止在中断期间过热。冷却板后，将硅胶天花板垫牢固地压入井中以密封它们。

然后将板固定在组织破坏器中。以 30 赫兹摇动盘子一分钟。然后将板旋转 180 度并重复摇晃一分钟。

将板子牢牢地敲击在长凳上两到三次，以清除柔性天花板薄膜上的任何砂砾。将板组2， 400倍G离心两分钟，以收集孔底的样品。然后取下硅胶盖并拉下天花板薄膜。

为了制备蠕虫消化物的十倍连续稀释，在96孔板的B至D行中填充180微升一个X PBS。使用设置为200微升的多孔移液器，通过移液缓慢混合蠕虫消化物。将最大量的液体转移到含有PBS的96孔板的A行。

使用多通道移液器，从顶排取出20微升，分配到B行中，然后混合。对B行到C重复此步骤，然后对C行到D重复此步骤以获得1000倍稀释度，用于单定植蠕虫的细菌定量。在固体琼脂平板上平板每次稀释10至20微升。

对于多物种定植，将每次稀释液100微升平板在10厘米琼脂平板上。使用该协议，在冷麻痹蠕虫的表面漂白后观察到有效的外部消毒，如缓冲液中外部细菌的减少所见。不影响肠道相关细菌。

手动破坏蠕虫导致更多的异质性。碳化硅砂砾是带或不带三安达斯的破碎的理想选择。在96孔法中，大玻璃珠不适合96井技术。

小玻璃珠产生一致的结果，但在尖端堵塞了管道。在同一细菌池上定植的蠕虫在观察单个细菌和多物种细菌群落时显示出肠道负荷的高度变化。用表达GFP的细菌定植的蠕虫在单个蠕虫测量中显示出异质性。

对于这种表达GFP的细菌菌株比较野生型布里斯托尔伦两种蠕虫的定植。对DAF的两个IGF突变体表明，DAF 16突变体支持更多的细菌种群，而DAF两个对定植具有抗性。这种异质性是特征性的，并且在同一实验的不同运行中保持一致。

与单个蠕虫数据相比，发现重新采样数据以模拟批次摘要会改变分布。每条蠕虫批量外推CFU以导致生物变异损失的单个数据的算术平均值为中心。代替继续消化活表面漂白剂和冲洗蠕虫可用于进一步的实验。

一旦蠕虫从寒冷中移开，运动将迅速恢复。