经口喂养和显微注射对成年蚊子进行实验性病毒感染

该协议可以确定肠道和甲状腺是否阻碍病毒传播，并有助于对埃及伊蚊传播的蚊媒病毒进行风险评估。我们的方案包括两种感染方法，口服喂养和胸内注射，可以有效评估虫媒病毒的媒介能力。该方案可能适用于各种蚊媒中的其他虫媒病毒感染，例如伊蚊中的登革热病毒和寨卡病毒感染，并且可能被证明是一种可行的程序。

演示该程序的将是我实验室的研究助理Fei Wang。要使用人工蚊子喂养系统进行人工喂养，请将胶原蛋白膜切割成适当的大小，并用O形圈将它们固定在水库中。在储液槽中加入三毫升病毒-血液混合物，并用塑料塞密封储液器以防止泄漏。

将装有蚊子的塑料杯放入手套箱。将密封的储液罐拧入 FU1 进料器，然后将一个储液器放在一个杯子上。打开动力装置，喂蚊子一小时。

喂食后，用冰麻醉蚊子几秒钟，直到它们晕倒。将麻醉的蚊子倒入放在冰上的培养皿中，并迅速盖上盖子。用镊子挑选充血的雌蚊，并以每杯50只雌蚊的速度将它们转移到新的塑料杯中。

用切好的蚊帐网包裹杯子，并盖上中间有孔的盖子。将海绵切成小块，然后放在杯子上。使用塑料一次性滴管将8%葡萄糖溶液添加到海绵上。

将装有雌性蚊子的杯子放入27摄氏度，湿度为80%的培养箱中10天。每 72 小时更换一块新的葡萄糖饱和海绵。对于胸内接种，请按照文本手稿中的说明准备雌性蚊子。

要准备传染性病毒稀释液，请从 80 摄氏度的冰箱中取出病毒原液，然后在冰上解冻。用含有 10%FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 RPMI 1640 培养基在含有 100 至 500 个斑块形成单位病毒的 100 纳升病毒稀释液下稀释病毒原液。将病毒稀释液放在冰上。

接下来，使用Puller 1000准备显微注射针，其中拔针器程序中的参数设置为热指数为450，重力（g）为110，距离（毫米为1），延迟（以秒为单位）为零。用镊子在解剖显微镜下以 16 倍放大倍率切割拉针的尖端。通过一次性无菌注射器用矿物油回填针头。

按照机器上的说明将针头连接到注射器中。小心地将针头插入含有传染性病毒稀释液的管中。然后，按下填充按钮将大约四微升的病毒稀释液填充到针头中。

针头填充后，请勿触摸或损坏针头。用镊子挑选大约50只雌性麻醉蚊子，并将它们放在冰板上。将板放在注射器下方，并在解剖显微镜下将针头插入蚊子的胸腔。

将注射体积设置为 100 纳升，将速率设置为 50 纳升/秒。按下注射按钮，让病毒溶液流入蚊子体内。注射成功后，腹部略微隆起。

将受感染的蚊子放入放在冰上的新塑料杯中。当受感染的蚊子数量足够时，用切好的蚊帐网包裹杯子，并盖上盖子。要收集受感染的雌性蚊子的唾液，请将麻醉的蚊子倒入放在冰上的培养皿中，并迅速盖上盖子。

将装满浸油的 10 微升移液器吸头并排放在橡胶泥上。用镊子挑出雌性蚊子，然后把它们放在冰盘上。用镊子取出他们的腿和翅膀。

将一只蚊子的口器放在每个移液管尖端上，以收集蚊子在室温下分泌到油中的唾液。45至60分钟后，将移液器吸头放入含有200微升病毒稀释剂培养基的1.5毫升管中。将试管以 5， 000 g 在 4 摄氏度下离心五分钟，以将唾液排出到试管中。

将含唾液的试管储存在80摄氏度下，以便随后测定传输速率。收集唾液后，解剖受感染的雌性蚊子。使用镊子切下蚊子的头部，并将每个头放入装有200微升RPMI 1640培养基的单独管中。

用镊子抓住胸部。然后，用另一个镊子抓住腹部的倒数第二段，将肠道拉出。清洁肠道中任何杂散的组织和器官。

用PBS清洗肠道，并将每个肠道放入装有200微升RPMI 1640培养基的单独管中。将这些试管储存在80摄氏度，以便随后确定病毒传播和感染率。在这项具有代表性的分析中，确定了感染后10天雌性蚊子肠道，头部和唾液中的病毒RNA。

胸内接种蚊子内脏、头部和唾液中埃比努尔湖病毒的病毒滴度高于口腔感染蚊子。胸内接种蚊子的感染率和传播率分别为100%和70%和38.1%。胸内接种蚊子的传播率高达90%，但口腔感染蚊子的传播率仅为4.8%，由于摄食量会影响病毒含量，因此挑选充血的雌性蚊子以保持一致性。