用于生物医学研究的3D犬肝和肠类器官培养物的标准化和维护

犬肝和肠道类器官培养方案对于标准化这项新技术非常重要。该技术允许可靠且可重复地建立犬类器官培养，包括类器官分离，维持，收获和随后的样品生物库。犬类器官可以为生物学，传染病开发，药物测试和发现以及传播医学等众多应用提供出色的模型。

首先，准备五个15毫升离心管，其中5毫升1X完全螯合溶液，一管装3毫升1X完全螯合液，一个空管，一管装5毫升1X完全螯合液，以及两毫升胎牛血清。在隔离当天，将无菌培养皿，手术刀，冰桶和冷的高级DMEM营养混合物F12放在生物安全柜中。将所需数量的24孔细胞培养板放入二氧化碳培养箱中预热。

将溶解的细胞外膜基质放在冰上进行解冻。将离心机预冷至四摄氏度。将含有生长因子的完整培养基从冰箱移至37摄氏度的水浴中，避免直接光照。

在运输管中摇动组织样品30秒。通过在液体表面附近缓慢移液直到管中留下0.5毫升，去除多余的上清液而不丢弃任何组织。将组织和剩余的上清液转移到无菌培养皿中。

使用一次性手术刀将组织切成类似麦芽浆稠度的小块并切碎约五分钟。将切碎的组织与液体从培养皿移入第一个完整的螯合溶液管，然后将两毫升先进的DMEM营养混合物F12加入培养皿中。冲洗剩余的组织并转移到第一个完整的螯合溶液管中。

涡旋1X完整螯合液管约五次，持续五秒钟。让活检在管的底部沉降一分钟，然后取出上清液，直到剩下五毫升。将1X完整螯合溶液从新管转移到样品管。

对以下两个管重复上一步。在最后两次洗涤时，取出管中剩余的三毫升上清液。将活检和1X完整螯合溶液从样品管转移到六孔板的一个孔中。

向样品管中加入三毫升1X完整螯合溶液。轻轻旋转以收集任何剩余的组织并转移到板的同一孔中。在孔中加入150微升0.5摩尔乙二胺四乙酸，并将六孔板放在20度24 RPM的摇臂上，温度为4摄氏度。

将肝脏样本孵育10分钟，将肠道样本在移动摇杆上孵育一小时。将六孔板转回生物安全柜，并将切碎的组织和液体转移到含有1X完整螯合溶液的管中，并含有胎牛血清。让组织沉降并将具有0.2毫升组织上部的上清液输送到空管中。

在4摄氏度下以700 XG旋转含有样品的管子五分钟。干细胞现在与切碎的组织一起沉淀。小心地除去并丢弃上清液，以免干扰沉淀。

将颗粒重悬于先进的DMEM F12中。再次旋转管并吸出上清液而不干扰沉淀。将溶解的细胞外膜基质的计算体积加入样品管中。

取出培养基时要小心，以免丢失细胞沉淀。当加入细胞外膜基质时，缓慢移液，以免在类器官悬浮液中产生过多的气泡。将样品与溶解的细胞外膜基质一起保存在冰上，并将悬浮液接种在孔的中间，以使溶解的细胞外膜基质形成圆顶状结构。

将板转运到培养箱中，让溶解的细胞外膜基质凝固30分钟。在具有生长因子的完整培养基中混合ROCK抑制剂和GSK3β，并向每个孔中加入500微升该溶液。将板放入培养箱中。

犬类器官方案通常每孔产生约50， 000至150， 000个肠或肝细胞。干细胞分离后，肝犬类器官作为膨胀的球体开始其生命周期，七天后，它们变成萌芽和分化的类器官。计算了旋转椭球体的体积、表面积、2D 椭圆面积和周长。

使用2D椭圆面积和周长来评估类器官培养物的健康状况。半定量评价标记物表达结果显示，球状体优先表达胆管细胞标志物KRT7，范围为1~26%，干细胞标志物LGR5表达范围在0.17~0.78%之间，而肝细胞标志物表达程度较低，叉头盒1A为0.05~0.34%，细胞色素-P450为0.03~0.28%。用胰蛋白酶样蛋白酶孵育12分钟不会抑制类器官生长。

然而，使用24分钟的孵育对类器官的生长产生了负面影响。分析犬类肝脏类器官在不利环境下的生存能力，以确定肝脏类器官成功生长和存活所需的类器官培养基和基底基质的体积。类器官的存活率从12.9天到18天不等。

基本的细胞培养技术和无菌方法是正确分离和维持类器官的基本先决条件。