鹌鹑绒毛膜尿囊膜 - 光动力诊断和治疗的工具

我们将向您展示如何制备日本鹌鹑卵外培养物以及如何使用绒毛膜尿囊膜或CAM简而言之用于癌症或微生物感染的光动力诊断和治疗。这种方法的优点是发育迅速，体积小，易于接近组织，易于处理。此外，它尊重进行动物研究的3R规则的原则。

由于其与膀胱、肺或胎盘等粘膜的结构相似，因此适用于潜在药物的体内试验、毒性试验或移植研究。演示该程序的是我实验室的博士生Barbora Kundekova和Majlinda Meta。首先，在孵化开始前使用新鲜或储存在 10 至 15 摄氏度下的受精鹌鹑蛋最多 4 至 5 天。

仅使用干净且未损坏的种蛋，然后将种蛋在湿度为 50% 至 60% 和 37.5 摄氏度的强制通风培养箱中孵化约 54 小时，水平放置并关闭种蛋旋转。用70%乙醇消毒鸡蛋表面，不要旋转鸡蛋。接下来，戴着手套在无菌层流柜中，使用小型无菌手术剪刀打开蛋壳并将内容物转移到 6 孔培养板中。

每个鸡蛋后，用70%乙醇对剪刀进行消毒。在 6 孔板的间隙中加入大约 5 毫升无菌水，因为湿度对于防止 CAM 变干至关重要。接下来，用真空吸气器吸出尖端不当的胚胎或未受精的卵子，然后将胚胎放入培养箱中直到进一步实验，同时在 37% 至 80% 的湿度下保持 90 摄氏度的温度。

当CAM足够发达时，通常从胚胎第7天开始，沿着小毛细血管在CAM表面上放置一个无菌硅胶环，同时避开主要血管。在无菌条件下，将适量的金丝桃素溶液30微升涂在硅胶环上，并将胚胎保持在37摄氏度，湿度为80至90%的培养箱中。为了进行光动力诊断，使用紫色激发光照射CAM，并在金丝桃素给药后用数码相机以不同的时间间隔记录金丝桃素和CAM组织和肿瘤细胞的荧光。

如果研究需要白光下的CAM图像，请在金丝桃素给药前和组织固定前不久的实验结束时记录CAM，因为光会触发金丝桃素的光活化。要在应用金丝桃素后进行光动力治疗，请将 CAM 放置在光纤下方，以使激光束覆盖硅胶环内的整个区域。在进行体内照射后，在这种特殊情况下，使用405纳米激光以每平方厘米285毫瓦的通量率记录CAM，在光动力处理前后使用白光和/或荧光记录CAM。

将 CAM 组织固定在含有 4% 多聚甲醛的 PBS 培养板中至少 2 小时，最多过夜，然后去除多聚甲醛并小心地从 CAM 中切出硅胶环内的一部分组织。所有这些步骤都应该在通风橱中完成。将CAM组织中的切割部分在水中洗涤10分钟，然后在升序酒精系列中脱水，方法是将CAM组织放入70%乙醇中3分钟，将伊红溶液2分钟，苏罗辛96%乙醇中5分钟，100%乙醇5分钟，并在二甲苯中两次在新培养皿中10分钟。

随后，使用刮刀或细刷将样品尽快转移到培养皿中溶解的石蜡中。24小时后，将组织放入组织学模具中，用石蜡包埋培养基填充并在冰箱中凝固，然后从包埋培养基上切下固化的CAM，将其在托盘中旋转90度，再次填充包埋培养基并使其凝固。在切片机上准备 5 至 10 微米切片进行组织病理学分析，以确定 PDT 诱导的损伤。

为了准备用于组织学的冷冻CAM切片，请小心地将天然或4%多聚甲醛固定的CAM安装在载玻片上，用OCT将嵌入模具填充成两半，并在液氮或干冰和乙醇的混合物中冷冻。冷冻后，小心地倾斜CAM并将其从载玻片滑到冷冻的OCT介质的顶部。再次放入模具中，用OCT培养基覆盖并如前所述冷冻。

为了分析CAM脉管系统，需要整个CAM样品。在层流柜中，用4%多聚氰醛和2%戊二醛在PBS中的预热固定溶液溢出CAM，然后在48小时后除去固定溶液。接下来，用微型剪刀和细刷小心地将CAM与胚胎分开，并在PBS中洗涤，然后将洗过的CAM安装在载玻片上，让它慢慢干燥。

之后，使用透射仪中的数码相机作为均匀白光源拍摄载玻片。加入金丝桃素后，在白光和荧光灯下观察肿瘤在CAM表面上的位置。组织学分析显示，异常鳞状细胞的同心结构侵入健康组织，伴有水肿和膜增厚。

用PDT处理后，观察到环内和周围区域的血管密度明显差异。没有光敏剂存在的激光辐射不会造成任何与未经任何处理的对照相当的损害。用金丝桃素孵育3小时后，激光照射导致聚集的金丝桃素单构化引起的荧光，对脉管系统造成广泛损害。

组织学分析表明，未经处理的对照CAM具有相对均匀的厚度。然而，PDT处理导致CAM变得更薄，更脆弱。我们刚刚演示了如何制备鹌鹑卵外CAM测定以及如何使用它。

在保持指南的同时，这种方法很容易掌握，并且可以证明快速的结果。