RNA干扰在美洲蟑螂中的应用

该协议提供了一种研究美洲蟑螂的简单方法。一种常见的卫生害虫，也是中药的益虫。它将有助于通过敲除特定基因来探索美洲蟑螂多种生命活动的分子机制。

这项技术的主要优点是它可以敲除美洲蟑螂或其他不适合基因编辑的类似昆虫中的基因。该技术可用于探索各个领域，例如遗传和表观遗传调节，组织的发育过程，附属物的再生，交配行为以及美洲蟑螂的其他有趣方面。该技术易于操作且用途广泛。

我们建议在DSRA注射治疗期间保持动物健康。我相信新手在几次练习后可以轻松掌握这种技术。首先，用四毫米孔径筛将孵化的若虫与卵形目分开。

用玻璃管挑出新鲜出白色的南美白苣苔。将P.americana放入新容器中，等待正确的治疗阶段。在反应体系中，加入10微升T7 2X缓冲液，2微升T7表达酶混合物和2微克PCR产物。

最后，用双蒸馏水将总体积补足至20微升。手动轻轻倒置混合，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，然后在 70 摄氏度下孵育 10 分钟。以1至200的比例用DEPC水稀释每微升RNase A溶液4微克。

然后向系统中加入1微升每微升1单位RQ1 RNase游离DNASe和1微升稀释的RNase A溶液。在37摄氏度下孵育30分钟。然后加入总体积的10%的乙酸钠和三体积的异丙醇总体积。

手动轻轻倒置混合，然后放在冰上五分钟，在4摄氏度下以13， 000克离心10分钟。用移液器除去上清液。接下来，用75%乙醇洗涤残余物，用25%DEPC处理过的水，然后在4摄氏度下以13， 000g离心5分钟。

再次除去上清液，在室温下风干沉淀15分钟。然后用约100微升的DEPC水溶解双链RNA，并将其稀释至每微升2微克的最终浓度。在显微注射泵中设置程序，以确保每次注射的体积一致。

然后用DEPC水填充注射器8至10次来清洁注射器。将10微升注射器安装在微型注射泵上。然后启动泵，用10微升双链RNA溶液填充注射器。

用二氧化碳麻醉蟑螂，然后用镊子轻轻地捡起它们，用手将蟑螂送到针头上。接下来，通过两个腹部索米特之间的间隙水平插入针头，以对抗表皮。将双链RNA溶液注入蟑螂中，确保针尖尽可能靠近表皮，以避免损伤内脏。

最后，拔出针尖。将注射的蟑螂放入干净的生物测定容器中。等待大约10到20分钟，让他们从二氧化碳的影响中恢复过来。

用注射日期，双链RNA的类型和剂量以及美洲蒿草的年龄标记容器。选取Ddc或DOPA脱羧酶和Dpp或十五淀粉基因作为两个实例，观察双链RNA注射后麦芽蟑螂的表型，以动物无靶标的dsMocK为阴性对照。采用qRT PCR检测RNAi效率。

基因被显著敲低，dsDdc的P值小于0.01，dsDpp的P值小于0.05。具有敲低Ddc基因的P.americana由于黑化阻滞而具有白色表皮。在dsDpp注射的实验中，RNAi破坏了肢体再生。

昆虫应该是健康的，注射时不会造成伤害。这项技术提供了一种简单的方法来探索无法进行基因编辑的昆虫的基因功能，例如美洲蟑螂。