乳腺是高度动态的，在一生中经历多轮重塑。我们的方案允许捕获驱动健康和患病乳腺中组织重排的细胞动力学。我们的乳腺成像窗口带有可更换的盖子，可以长时间（长达数周）对乳腺进行纵向活体内成像。
乳腺成像窗口的可更换盖子可确保始终保持最佳的成像条件，并允许在成像会话之间进行组织操作或药物管理。我们的方法不仅提供了对健康乳腺生物学的见解，而且还使我们能够在单细胞水平上研究乳腺肿瘤的发生和进展。首先将乳腺成像窗口的盖子放在无菌表面上，并在整个边缘盖子周围涂上氰基丙烯酸酯粘合剂胶水。
小心地将10毫米圆形玻璃盖板放在盖子的顶部。使用无菌木棍定位玻璃盖板滑轨，并施加一些力将其向下推，以确保玻璃盖玻片和盖架之间的气密密封。确保玻璃没有遮盖盖子臂上的孔。
通过将盖子和乳腺成像窗口浸入80%乙醇中至少30分钟，在封闭的培养皿中对其进行消毒。使用浸泡在丙酮中的棉签去除玻璃盖玻片上多余的氰基丙烯酸酯粘合剂胶。为了让小鼠为手术做准备，使用剃须刀片剃除第四乳腺周围的区域。
使用第四个作为标志，并用粘性胶带去除松散的毛发。进行爪子抽出测试，以验证动物是否得到充分麻醉。用细小的Graefe镊子轻轻抬起皮肤，用小弹簧剪刀在第四个乳腺脂肪垫顶部的皮肤上做一个10到15毫米的对角线切口 使用第四个作为方向点，确保不要切割或损坏腹膜或乳腺。
使用切口线周围长达五到八毫米的钝解剖将皮肤与乳腺脂肪垫和下层组织层分开，以创建一个适合乳腺成像窗框的口袋。根据乳腺组织的宏观特征（包括淋巴结或肿瘤病变的位置）定义感兴趣区域或 ROI。尽量保持投资回报率在切口方面的中心位置。
使用无菌镊子拿起乳腺成像窗口，并测试切口是否足够大以插入窗口。如果需要，请稍微扩大切口，直到乳房成像窗口适合。取下窗户，使用5-0丝缝线将钱包线缝合线从尾端开始，从皮肤的外部到内部放置在距离切口边缘一到两毫米的地方。
沿着切口向上移动约五毫米，并将缝合线从内到外穿过皮肤。沿着切口的边缘重复此过程，从而形成由五到六个环组成的圆形缝合线。缝合线的最终出口应位于距离第一个入口约两到五毫米的地方。
将乳腺成像窗口安装在切口内，并使用Graefe镊子小心地将皮肤放在窗口的凹槽中。确保将缝合线的环留在外面。拉动钱包线缝合线的环，轻轻拉动缝合线的两端，将其拧紧在乳腺成像窗口的凹槽中。
用手术结绑住，切掉多余的线。使用牙签将凡士林涂抹在窗户的内缘，避开下面的组织。用无菌镊子轻轻向下推窗框，然后将盖子放入窗框。
这将避免乳腺组织和乳腺成像窗盖之间的空气量。将薄镊子的尖端穿过盖子臂上的孔，并通过顺时针扭转盖子来拧紧盖子。如果拧紧盖子后仍有一些空气，将无菌胰岛素针通过皮肤引入乳腺组织和盖子之间的腔内，并缓慢拉出柱塞，从而在乳腺组织和乳腺成像窗盖之间产生真空。
现在，在此过程后可以很容易地观察到淋巴结。检查乳腺成像窗框和盖子的状况，包括缝合线的稳定性或盖子的任何潜在损坏。将鼠标放置在镶嵌物上，使乳腺成像窗口落在成像盒嵌体的孔中。
在鼠标背面涂上半透明和纸胶带，以稳定鼠标并减少由于呼吸引起的组织运动。对于超过三小时的成像过程，将一根柔性针皮下注射在鼠标颈部，并用纸胶带固定。将带有营养混合物的10毫米注射器连接到柔性硅胶管上，并将营养混合物推至到达管的末端。
将硅胶管连接到柔性针头上，每30分钟注射50微升输注溶液。将盖子放在成像盒上以将其关闭。然后，将成像盒固定在显微镜的载物台上。
验证鼠标在成像盒内是否稳定。使用显微镜的落射荧光模式定义感兴趣区域并应用显微镜设置。使用成像软件导航器模式中的螺旋功能生成大型概览图块扫描并创建组织的参考图。
在"螺旋"（Spiral） 概视图内定义感兴趣区域，然后定义上下 Z 平面以确定 Z 堆栈。按"开始"键可获取组织的详细三维或四维 Z 堆栈。将薄镊子的尖端穿过盖子臂上的乳腺成像窗口孔，并通过逆时针扭转来松开盖子。
或者，可以使用无菌钝镊子操纵或重新定位组织，以优化特定感兴趣区域的成像条件。将凡士林涂抹在乳腺成像窗口的内缘，避开下面的组织。用无菌镊子轻轻向下推窗框，然后将盖子放入窗框。
最后，将薄镊子的尖端穿过盖子臂的孔，并通过顺时针扭转盖子来减轻盖子。向青春期Rosa26 Cre / ERT2 Rosa26膜番茄膜GFP小鼠注射低剂量的他莫昔芬，导致Rosa26膜番茄膜GFP等位基因的Cre介导重组。在第一天，第三天和第五天对小鼠进行成像，以跟踪发育中的乳腺的动态变化。
代表性图像显示了通过乳腺成像窗口成像的多天内细长和分支的乳腺导管的3D渲染。此处显示了分支尖端和伸长分支的单个 Z 平面图像。基质中的单个细胞由白色星号突出显示。
代表性图像显示通过乳腺成像窗口成像的小鼠腹股沟淋巴结。二次谐波产生以绿色表示。这里显示了成年雌性E-钙粘蛋白膜CFP小鼠连续多天的乳腺导管结构的3D渲染图像。
胶原I模式用于追溯相同的ROI，并使用E-钙粘蛋白膜CFP信号来标记导管细胞。在暴露于紫光之前和之后的零天对Kikume绿红色小鼠进行成像。在转换后的第2天，第6天和第10天重复成像会议。
通过乳腺成像窗口对乳腺的同一区域进行成像10天。较小的区域在零日被光转换，并且随着时间的推移显示出相似的Kikume红色信号的稀释率，表明整个上皮的周转率相等。指示区域的缩放图像在光转换后6天和10天在细胞水平上显示增殖异质性。
光转化后10天不同细胞的红绿比的定量揭示了同一导管微环境中某些细胞的高度可变稀释率。该过程的关键步骤是在成像会话之间打开盖子。窗口的这一独特功能改善了成像条件，并允许对组织进行纵向成像。
带有可更换盖子的乳腺成像窗口将促进有关小鼠乳腺肿瘤启动和进展领域的体内，快速药物测试和筛查的新问题。
