通过显微注射在类 圆线虫 物种中产生转基因和敲除

使用显微注射将DNA构建体递送到类圆线虫中，使我们能够产生敲除和转基因，这可以用来研究这些蠕虫如何发育，导航其环境并寄生宿主。到目前为止，这是在这些寄生虫中产生敲除和转基因的唯一成功技术。在显微注射前一天，使用玻璃巴斯德移液器将180微升琼脂糖溶液加入盖玻片上，然后立即在上面滴下第二个盖玻片，将琼脂糖压平到薄垫中。

5到10秒后，通过将顶盖滑开来取下顶盖滑轨，并确定琼脂垫在哪个滑块上，然后面朝上放置。然后，从破碎的盖玻片中选择一小块玻璃碎片，并使用镊子将其轻轻按入垫子顶部边缘附近的琼脂中。在显微注射当天，将 Baermann 支架排成一行，这是一个由两个塑料环制成的筛子，其中两层尼龙杜层面网用三块重叠的实验室组织固定在它们之间。

然后将粪便 - 木炭混合物加入贝尔曼支架中。接下来，将Baermann支架与粪便 - 木炭混合物放在漏斗中，将粪便 - 木炭混合物周围的组织碎片折叠，并加入足够的水以淹没大部分粪便炭。然后，在漏斗顶部加一个15厘米的塑料培养皿盖，以容纳气味并根据需要标记漏斗。

一到两个小时后，将50毫升离心管放在漏斗底部的橡胶管下，小心地打开底部的夹子，将30至40毫升含有蠕虫的水分配到50毫升管中。然后。将含有蠕虫的15毫升Baermann水转移到15毫升离心管中。旋转管子，除去多达13毫升的上清液，并将其丢弃到装有碘的液体废物容器中以杀死任何蠕虫。

收集完所有蠕虫后，检查管底部的蠕虫颗粒。如果没有可见的蠕虫，请等待一到两个小时，然后从Baermann设备中收集更多的蠕虫。将蠕虫在尽可能少的水中转移到带有大肠杆菌HB101草坪的六厘米2%线虫生长培养基板上，并将该板用作显微注射的源板。

在解剖显微镜下，使用标准铂蚯镐用卤烃油覆盖显微注射垫盖玻片上的玻璃碎片。然后，将显微注射垫盖滑放在显微注射镜上，并找到覆盖有油的玻璃碎片。对齐玻璃碎片，使边缘垂直于针的方向，以用作用于折断针的表面。

接下来，使用解剖显微镜，确保针在锥形轴中没有气泡或碎屑，然后将针固定在加压支架中1至1.5厘米。用眼睛将针尖放在显微镜视场的中心，并在低放大倍率下，将针尖定位在垂直于玻璃碎片侧面的视场中。然后，切换到更高的放大倍率，并将针尖与玻璃边缘对齐，靠近但不接触它。

接下来，要打破针尖并允许液体流动，轻轻敲击玻璃片侧面的针头，同时施加来自气体的连续压力。一旦液体开始流动，检查尖端的形状，并确保它与容易流动的液体一起尖锐。当液体从针头流出时，将显微注射载玻片移动到解剖范围内，并在琼脂垫上加入一到两微升的卤烃油以放置蠕虫。

将20至30个年轻成年圆线虫转移到没有细菌的2%线虫生长培养基板上至少五分钟，以除去多余的表面细菌并选择单个蠕虫进行显微注射。注射时根据需要向板中添加更多蠕虫。在蠕虫镐上使用少量卤烃油，从没有细菌的平板中选择一个类圆线虫的年轻成年雌性，她的性腺中有一到四个卵，并将蠕虫转移到琼脂垫上的一小滴油中。

使用蠕虫镐，轻轻定位蠕虫，使其不卷曲，性腺可见且易于接近。然后，将蠕虫定位在显微显微镜的视场中，确保性腺与针位于同一侧，并且定位使针以轻微的角度接触性腺。接下来，将针尖带到同一焦平面中蠕虫的一侧。

然后，瞄准靠近蠕虫中间的性腺臂，使用显微注射器将针头轻轻插入性腺。立即对针头施加压力，用DNA溶液轻轻填充整个性腺手臂。注射足够的液体后，取出针头并观察伤口是否闭合。

如果性腺的另一臂可见，则重复该过程。注射完成后，通过在琼脂垫上用针尖施加压力来快速验证针头是否堵塞，然后将注射蠕虫的载玻片转移到解剖显微镜。为了恢复注射的蠕虫，首先在蠕虫上滴几滴蠕虫缓冲的盐水，使其漂浮在琼脂垫上。

然后在蠕虫镐上收集少量细菌，并用粘附细菌触摸蠕虫以将其从液体中除去。轻轻地将蠕虫转移到回收板上。对于行为实验，将20至30只幼虫转移到具有厚厚的HB101细菌草坪的2%线虫生长培养基板中，并在荧光解剖显微镜下，鉴定表达感兴趣转基因的幼虫。

然后，使用蠕虫镐，选择转基因幼虫并将其放入装有蠕虫缓冲盐水的小手表玻璃杯中。对于显微镜检查，使用剃须刀片，在10厘米趋化性板的塑料底部划出网格，以轻松跟踪板上蠕虫的位置。接下来，将蠕虫缓冲盐水中的三微升幼虫加入网格上的正方形中，根据需要填充尽可能多的正方形。

然后在水中加入15至20微升的1%尼古丁滴到蠕虫滴剂中。四分钟后，当蠕虫瘫痪时，使用荧光解剖显微镜对其进行筛选。转基因类圆线虫类固醇幼虫具有不完全和完整的act-2 mRFPmars表达模式， 如下所示。

当转基因未整合到基因组中时，体壁肌肉中的斑片状表达更常见。相反，整个体壁肌肉的一致表达通常表明转基因已经整合到基因组中。关键步骤是将针头定位在与性腺相同的焦点平面上，以确保DNA被注射到性腺中，并将掺入发育中的卵子中。

该技术的发展使得研究寄生线虫的基因功能成为可能，这为寄生和宿主 - 寄生虫相互作用的机制提供了新的见解。