使用无细胞自动诱导工作流程在24小时内从细胞到无细胞蛋白质合成

无细胞自动诱导方法减少了研究人员的监督和生产功能性细胞提取物所需的时间。这简化了以前的体外蛋白质合成方案，这些方案更加耗时和密集。这种技术不那么复杂，而且产量也很高，这将使更多的受众能够实现无细胞表达。

这种方法突出了细胞生长期间和无细胞反应中能量代谢的重要性。首先制备960毫升无细胞自动诱导培养基。然后，在2.5升挡板烧瓶中通过121摄氏度高压灭菌30分钟对培养基进行灭菌。

接下来，在制备40毫升糖溶液后，将其过滤灭菌到单独的高压灭菌玻璃容器中。高压灭菌后，当培养基冷却至40摄氏度以下时，将过滤灭菌的糖溶液直接加入培养基中。接下来，通过从先前条纹的新鲜大肠杆菌BL21星板中滑动充满菌落的环并将环直接插入培养基来接种培养基。

将环旋转到介质中，而不接触容器的侧面。然后，将接种的培养基置于30摄氏度的培养箱中过夜，并以200 RPM的转速振荡。第二天，通过将一升培养基转移到一升离心机瓶中并在4至10摄氏度之间以5， 000倍G离心10分钟来收获细胞。

丢弃上清液后，使用无菌刮刀将沉淀转移到预冷且先前称重的50毫升锥形管中。接下来，用30至40毫升冷S30缓冲液洗涤颗粒一次，方法是在30秒内通过涡旋重悬颗粒，并在冰上休息。在沉淀完全重悬后，离心细胞重悬，丢弃上清液，并使用干净的组织，从50毫升管的内壁擦拭任何多余的上清液而不接触沉淀。

然后，在液氮中快速冷冻之前称量沉淀，并将其储存在零下80摄氏度直至进一步使用。为了制备细胞提取物，每克冷冻细胞沉淀物加入一毫升S30缓冲液，并使沉淀在冰上解冻30至60分钟。然后，通过涡旋以30秒的间隔重悬解冻的颗粒，并在冰上休息，直到没有可见的细胞团块。

对于细胞裂解，将1.4毫升等分试样的细胞悬浮液转移到1.5毫升微量离心管中。然后，以20千赫兹的频率和50%振幅的频率超声处理每个管中的细胞悬浮液，每次爆发45秒，每个周期在冰浴中休息59秒，在循环之间反转管子，在最后一次超声处理循环后，立即加入4.5微升一摩尔二硫舒醇。在所有管中超声处理细胞悬浮液后，离心管并将上清液收集在600微升等分试样中，放入新鲜的1.5毫升微量离心管中。

快速冷冻并将等分试样储存在零下80摄氏度，直到进一步使用。要在1.5毫升微量离心管中以四倍的方式进行15微升无细胞蛋白质合成反应，解冻一等分试样的细胞提取物。在制备每个15微升反应混合物后，让反应在37摄氏度下运行至少四个小时。

为了量化报告蛋白，将48微升50毫摩尔HEPES缓冲液在pH 7.2下与每个无细胞蛋白质合成反应产物的两微升结合在黑色聚苯乙烯96孔板中。使用485的激发波长和528纳米的发射波长来量化超折叠绿色荧光蛋白或sfGFP的荧光强度。然后，通过使用纯化的pJL1 sfGFP质粒创建标准曲线，将相对荧光单位转换为sfGFP的体积产率。

这里显示的是细胞收获后在600纳米处测量的不同光密度下无细胞的自诱导培养基沉淀。生长到光密度为10的培养基在总提取物中产生比生长至光密度为2.5的培养基更高的细胞沉淀量。对总蛋白浓度的进一步分析表明，两种提取物之间的总蛋白没有显着差异。

尽管培养基生长到不同的光密度水平，但两种提取物在表达sfGFP的无细胞反应中显示出相似的结果。在制备培养基和糖溶液时保持无菌条件很重要。这种CFAI细胞提取物方法可用于大多数无细胞表达的应用。

这些范围从生物技术教育到蛋白质工程，以及床旁诊断。该方法减少了所需的时间和技术技能，提高了可重复性，并产生了更多的提取物。