斑马鱼胚胎快速心脏动力学的光片显微镜

我们的实验方案提供了一种优化的工具，用于研究体内斑马鱼心脏，并描述了嵌入固定技术以及用于心脏成像的数据采集和分析管道。斑马鱼是一种心脏模型系统，在药物筛选等应用中具有很大的潜力。在研究心脏病时，能够在生理条件下进行温和成像的方案至关重要。

这里介绍的工作流程侧重于斑马鱼胚胎心脏成像，但修改后的版本可以应用于各种其他样品和实验，包括鱿鱼，蠕虫和水螅。首先收集从所需转基因系的育种中获得的胚胎。将胚胎保持在28摄氏度，放在装满E3鱼培养基的培养皿中。

使用安装在显微操作器上的孔玻璃针并连接到微微量注射器，将30皮克α-bungarotoxin mRNA注射到一个或两个细胞阶段胚胎的蛋黄中以固定鱼。将鸡蛋保持在28摄氏度的培养皿中，放入装有E3培养基的培养皿中，每24小时将鸡蛋转移到含有新鲜E3培养基的新培养皿中，直到成像。为了防止色素形成，如果斑马鱼的背景不是白化病，请在受精后25小时将鱼转移到含有含有0.2毫摩尔酪氨酸酶抑制剂1-苯基2-硫脲（也称为PTU）的E3培养基的新培养皿中。

要拉直氟化乙烯丙烯管，请将管子放在玻璃或钢高压灭菌器安全管中，其内径正确，以适合聚合物管，并在180摄氏度下高压灭菌器两小时。一旦管子达到室温，取出拉直的聚合物管。要清洁管子，请使用50毫米注射器用一摩尔氢氧化钠冲洗管子两次。

将离心管切成50毫升离心管的大小，放入充满0.5摩尔氢氧化钠和超声波的离心管中10分钟。用双蒸馏水冲洗氟化乙烯丙烯管，然后用70%乙醇冲洗。将新鲜离心管中含有70%乙醇和超声波10分钟的离心管转移。

超声波后，最后一次用双蒸馏水冲洗管，并将其储存在含有双蒸馏水的离心管中。将低熔点琼脂糖溶解在E3培养基中后，将熔化的琼脂糖倒入玻璃或塑料培养皿中，制成一到两毫米的涂层。琼脂糖凝固后，轻轻地将E3培养基倒在琼脂顶部以防止干燥。

用石蜡膜密封板并储存在四摄氏度。解冻三卡因的储备溶液，并将0.02%三卡因加入不含甲基蓝的E3培养基中用作包埋培养基。使用一次性玻璃移液器将鱼转移到包埋介质中。

验证鱼是否已停止移动，并且心脏以与对照组相似的速度跳动。用剃须刀片将氟化乙烯丙烯管切割成理想长度。准备一个带有钝端套管的注射器。

用空气填充注射器，然后将管子安装到针头上，并通过清空注射器轻轻冲洗掉任何剩余的水。接下来，用介质填充安装在注射器上的氟化乙烯丙烯管。将胚胎插入管中，使鱼头靠近管端，避免气泡形成。

使用剃须刀片，小心地切开管末端导管或针头边缘的管子。在丢弃琼脂涂层盘顶部的任何液体后，将管子直接插入琼脂中。旋转管子并将其取出，以从琼脂糖床中释放插头。

验证管末端是否存在琼脂塞。对于长期成像，在每个基本方向上切入三到五个孔，通过放置垂直于管轴的剃须刀片，并在管子上切开30度直到到达安装介质，在鱼的末端上方至少五毫米。然后，在180度处做第二个切口以创建一个孔并滚动管子以清楚地可视化切口。

将安装的胚胎转移到含有包埋培养基的1.5毫升微量离心管中，直到准备好成像。将试管安装在样品架中，并用嵌入介质填充成像室。将样品架放在载物台上，样品浸入腔室。

通过目视评估心率来检查嵌入的鱼的健康状况，如果心跳太慢，请丢弃样品。始终使用相同的样品位置进行可重复的成像，并旋转鱼，使两只眼睛都在焦平面上。然后，在受精成像后，逆时针旋转鱼约20至30度48小时。

当鱼适应了激光功率时，选择提供最佳图像质量的照明侧。在每个 Z 平面上，以每秒 300 帧或更高的速度记录四到五个检测信号。为了记录跳动的心脏，将样品逐步穿过光片，并使用一到两微米的Z间距覆盖整个心脏深度。

将4D文件加载到3D渲染软件中，以浏览数据并生成渲染斑马鱼心脏的电影。在受精后48小时，心脏刚刚经历循环，有两个腔室，心室和心房，但尚未发育瓣膜。不同的心脏结构，如心室、房室管、心房、流入道和流出道，很容易区分。

数据表明了精确的跳动，并揭示了心脏的两个细胞层，心肌，收缩和产生力的单细胞肌肉层以及心内膜（连接心脏和脉管系统的单细胞层）之间的复杂相互作用。最重要的是始终在立体镜下验证样本运行状况和一致的心跳。虽然传统技术经常影响心脏形状或功能，但我们的方法为我们提供了跳动心脏的动态无扰动数据，帮助我们了解早期胚胎心脏的本质。