间充质干细胞调节巨噬细胞吞噬作用;定量和成像

这种共培养方法将有助于回答围绕间充质干细胞调节巨噬细胞吞噬作用背后的细胞接触机制的关键问题，从而阐明MSC在调节先天免疫中的作用。此技术可应用于高通量分析。与pH敏感染料偶联的生物颗粒仅在酸性吞噬体环境中发出荧光。

因此，清洗和淬火是必要的。该方法还可以应用于包括嗜中性粒细胞和其他吞噬细胞在内的各种共培养模型。演示该程序的将是Ethan Chetkof，他是目前在我实验室的本科生。

首先，观察培养的间充质干细胞的汇合。当达到70-80%汇合度时，在100毫米培养皿中从培养的细胞中吸出生长培养基并加入5毫升PBS。吸出PBS后，加入两毫升0.05%胰蛋白酶EDTA溶液，孵育细胞三分钟。

三分钟后，使用倒置显微镜检查细胞脱离。如果细胞没有分离，再次孵育一到两分钟。一旦所有细胞分离，向平板中加入五毫升新鲜生长培养基。

使用胰蛋白酶培养基混合物冲洗板后，使用无菌血清学移液管将细胞收集到干净，无菌的50毫升锥形管中。接下来，通过离心将细胞沉淀下来。吸出上清液后，通过轻轻上下移液将细胞沉淀重悬于10毫升新鲜生长培养基中。

对于细胞计数，将10微升细胞悬浮液加入含有30微升0.4%台盼蓝溶液的1.5毫升微量离心管中，然后在血细胞计数器计数室的盖玻片下加入10微升混合物。在倒置或明场显微镜下，使用10倍物镜和四个一平方毫米腔计算未染色的活细胞，并计算文本手稿中描述的细胞数。使用公式C1V1等于C2V2来确定制备最终浓度为每毫升10至第五个细胞的细胞悬浮液所需的新鲜培养基和细胞悬浮液的所需体积。

根据板设计，使用多通道微量吹管在96孔板的孔中加入100微升的细胞悬浮液。使用微量移液管根据板设计向每个腔室载玻片中加入530微升的细胞悬浮液并孵育过夜。制备10毫升含有干扰素γ的活化培养基，浓度为每毫升250纳克，用于在一个100毫米培养皿中活化巨噬细胞。

从巨噬细胞培养物中吸出生长培养基，并用不含干扰素γ的五毫升活化培养基冲洗细胞。在实验皿中吸入冲洗培养基后，加入10毫升补充有γ-干扰素的活化培养基。在对照皿中，加入10毫升不含干扰素γ的活化培养基，然后将细胞孵育16至24小时。

在孵育结束时，为了制备共培养物，从巨噬细胞中除去活化培养基并加入5毫升新鲜生长培养基。使用细胞提升器轻轻刮擦细胞并将细胞收集到50毫升的锥形管中。接下来，使用台盼蓝排除和血液细胞术计数细胞，然后制备对照和处理过的巨噬细胞悬浮液，浓度为每毫升10至第五个细胞，如前所述用于间充质干细胞。

从含有间充质干细胞的实验孔中轻轻吸出培养基。使用多通道微量移液器根据板设计在适当的实验孔中加入100微升处理的对照巨噬细胞悬浮液，并如图所示孵育过夜。从含有间充质干细胞的四壁腔载玻片中轻轻吸出培养基。

使用微量移液器根据设计将530微升巨噬细胞悬浮液加入适当的孔中并孵育过夜。将一毫升活细胞成像培养基加入含有一毫克Zymosan颗粒的小瓶中，并将培养基颗粒混合物收集到玻璃培养管中。在用额外的一毫升成像溶液冲洗小瓶后，将冲洗过的成像介质转移到玻璃管中，然后加入三毫升额外的成像溶液，以达到每毫升0.2毫克的Zymosan颗粒悬浮液。

使用快速脉冲涡旋Zymosan悬浮液30至60秒，然后使用探针超声仪用60个快速脉冲对悬浮液进行超声处理。吸出培养基后，用100微升活细胞成像溶液冲洗实验孔和试剂空白孔。接下来，从孔中吸出活细胞成像溶液，并加入100微升的Zymosan悬浮液。

使用触摸板界面打开荧光读取器的板托盘。将不带盖子的板放在托盘中，A1孔位于左上角。使用触摸板关闭托盘，然后单击顶部菜单中的绿色读取按钮。

为了进行吞噬作用测定，在用750微升成像培养基冲洗第一个实验井后，加入400微升的Zymosan悬浮液，将剩余的孔留在生长培养基中。接下来，将载玻片放在成像系统的培养台上。使用映像软件。

选择定位选项卡下的明场选项，然后单击目镜图标。10倍物镜就位后，使用目镜和对焦旋钮聚焦在细胞上。选择采集选项卡。

打开实验下拉菜单，选择一组波长，其中包括EGFP滤光片，以适应pH敏感染料的509纳米激发和533纳米发射波长。当计时器还剩下大约两分钟时，单击物镜菜单中的20X图标将物镜更改为20X，然后单击通道菜单，选择EGFP滤镜，然后在曝光菜单中，将曝光时间设置为400毫秒以检测pH敏感的绿色荧光团，然后单击实时。调整焦点后，单击停止以关闭灯光，然后选中顶部延时实验设置旁边的框。

在对焦策略菜单中，选择软件自动对焦，然后从下拉菜单中选择智能和核心设置，以减少在自动对焦运行时暴露在光线下的时间。在延时菜单中，将所需的采集次数设置为30到60，间隔时间设置为一分钟，然后单击开始实验按钮开始采集。研究了干扰素γ对共培养物的影响。

代表性结果表明，巨噬细胞与间充质干细胞的共培养增强了巨噬细胞的吞噬活性。干扰素γ处理降低巨噬细胞的活性。然而，在间充质干细胞存在下，巨噬细胞吞噬活性被部分挽救。

在这些研究中，最佳细胞密度至关重要。当巨噬细胞以过低的密度接种时，未检测到荧光强度的变化。当巨噬细胞以高密度接种时，所有组的荧光强度迅速升高，差异不明显。

在此过程中，最重要的事情之一是确保细胞密度得到优化并在实验之间保持一致。