门静脉注射结直肠癌类器官研究肝转移基质

超过50%的结直肠癌患者通过门静脉播散发生肝转移。目前研究结直肠癌肝转移的动物模型仍然不足以概括生物学过程。门静脉注射结直肠癌类肿瘤提供了一个富含成纤维细胞的肿瘤环境，可以研究结直肠癌肝转移中转移癌细胞和CAS之间的串扰。

该技术为评估针对结直肠癌肝转移的肿瘤微环境的治疗策略的疗效提供了平台。该方法对于研究CAS，肿瘤细胞和肿瘤微环境之间的相互作用特别有用。如果棉头未正确放置在注射部位，取出针头后可能会发生过度出血。

一旦找到注射部位，棉花尖端的浸泡就停止了。如果没有该过程的视觉演示，识别门静脉和可视化注射部位可能很困难。首先，使用加热垫上的无菌窗帘准备无菌手术区域。

此外，按照文本手稿中所述准备手术所需的所有器械。然后通过调整光源的位置来照亮手术区域。接下来，皮下注射每公斤体重0.1毫克的丁丙诺啡到小鼠中进行手术疼痛管理。

然后麻醉小鼠并使用电动剃须刀，在远离无菌手术区域的区域剃除中腹部至上腹部，以避免头发污染该部位。清洁切口部位，交替使用Betadine和80%乙醇对手术区域进行灭菌。重复三次。

将小鼠置于加热垫上的手术区域，以仰卧姿势进行异氟醚麻醉维持。然后在腹部放置一个带有孔的手术垂坠。用镊子抬起腹部皮肤，用剪刀在中线做一个两到三厘米的皮肤切口，只切开皮肤，确保切口的范围从中腹部到胸骨的xiphoid过程，而不是高于xiphoid过程的下端。

然后用镊子完全抬起腹膜壁，并用剪刀在腹膜上做一个类似的两到三厘米的切口。避免切开肠道和隔膜。接下来，用温盐水浸泡手术纱布，并将其放在外科医生右侧切口旁边。

使用浸泡有盐水的棉签轻轻地将小肠和大肠拉出，并将它们放在浸泡过盐水的纱布上。用额外的湿纱布覆盖肠道，以保持肠道湿润。接下来，用湿纱布轻轻地将肠道拉到外科医生的右侧。

然后施加轻柔的张力来观察门静脉。如果门静脉的可视化很困难，用湿棉签轻轻调整胃的位置。在将类瘤悬浮液轻轻管道数次以获得均匀的细胞悬浮液后，将100微升细胞悬浮液吸入连接到33号针头上的Hamilton或一毫升注射器中，避免气泡。

缓慢地将针斜面向上插入门静脉，插入深度为三到四毫米，针角几乎平行于门静脉。在30秒内缓慢注射肿瘤细胞，以防止门静脉阻塞。肝脏的颜色暂时从红色变为白色。

注射后，慢慢取下针头，立即用干燥的棉签对注射部位施加轻柔的压力五分钟。取下棉签，立即将止血海绵涂抹在注射部位。用棉签或镊子握住海绵，再轻轻按压五分钟。

五分钟后，取出止血海绵的压力，并确认注射部位没有出血。如果发生出血，立即用棉签进行压力止血约10分钟。然后再使用一块止血海绵，再涂抹五分钟。

确认没有出血后，取下肠道上的手术纱布。然后使用装有五毫升盐水的注射器，将盐水喷射到肠道以防止器官粘连。轻轻地将肠道放回腹腔内，并使用4-0个多乳素缝合线缝合腹膜。

然后用镊子抬起皮肤的两侧，使用皮肤吻合器关闭皮肤切口，小心不要钉住肠道。关闭异氟醚，但保持氧气流动。仔细监视鼠标。

当鼠标醒来时，把它放在加热垫上的空笼子里。监视鼠标，直到它有意识并正常行走。手术后四小时，皮下注射每公斤丁丙诺啡0.1毫克。

每天仔细监测小鼠一周，检查缝合线和伤口愈合。手术后7至10天，使用订书机去除器去除皮肤吻合器。尾静脉AAV-8 Islr注射后两周的RNA原位杂交显示Islr在肝脏中过表达。

注射AAV mRuby2两周后，将结肠癌类器官的单细胞悬浮液注射到小鼠门静脉中。从宏观上看，这种门静脉注射导致肝脏中出现多个白色肿瘤结节。由门静脉注射诱导的结直肠癌肝转移的苏木精和曙红染色显示，中度分化肾小管腺癌伴有增生性基质反应和坏死的组织病理学。

这种富含基质的组织学忠实地概括了人结直肠癌肝转移，使该模型适用于研究转移性肿瘤基质的转化研究。α平滑肌肌动蛋白的免疫组织化学证实了癌症相关成纤维细胞的存在，而Picro-Sirius红染色在肿瘤间充质中显示出丰富的细胞外基质。EPCAM的免疫化学研究显示，转移性结直肠癌表现为肿瘤萌芽，这是结直肠癌预后不良的一个特征。

Ki67标记指数约为80%，表明大多数肿瘤细胞具有有丝分裂活性。小鼠在将类瘤注射到门静脉后显示出57天的中位生存期。AAV-8 Islr处理的小鼠显示出小鼠存活率的改善，肿瘤的体内成像信号减少，骨形态发生蛋白信号传导增强，Ki67增殖细胞减少。

确保将棉尖涂在正确的注射部位，并且仅在出血停止后才施用止血海绵。可以使用IVIS成像监测肿瘤的建立，以确保肿瘤细胞在肝脏内生长。