小鼠内淋巴囊解剖

内淋巴囊是内耳正常发育所必需的。由于它无法在原位进行结构、生理和分子研究，因此从动物模型（尤其是小鼠模型）中解剖它是必不可少的。由于其薄而精致的上皮结构，以及它靠近和粘附于邻近组织，因此内淋巴囊的解剖和制备非常困难。

我们的方法有助于可视化和识别囊及其与邻近组织的分离。影响内淋巴囊正常功能的疾病和病症可导致听力和平衡丧失。我们的技术对于阐明内淋巴囊功能背后的细胞、分子和生理过程至关重要。

演示该程序的是我实验室的博士后访问研究员 Hyun Jae Lee。首先将内耳准备安排在含有 PBS 的 35 毫米组织培养皿中，第八对脑神经的根部朝上。使用 4 号镊子，将组织固定在耳蜗上并识别前庭导水管、前后半规管、普通管和乙状窦。

然后使用安装在 1 毫升注射器上的 27 号针头切开硬脑膜和前庭导水管，以及内淋巴囊周围的底层结缔组织。在内淋巴囊外侧的结缔组织中切开后，用镊子固定结缔组织并将其从颞骨上拉出，将其剥离。小心地清除任何残留的碎片，并将内淋巴囊上皮与周围组织分开。

为了解剖打开的内淋巴囊，握住制剂的茎部分以观察管腔的横截面。然后将一根 27 号针头插入管腔并移动它，将内淋巴囊切成两片。用镊子握住每个片状组织的边缘，并将它们彼此分开。

在代表性分析中，这些小鼠在去除半脑之前和之后的颅骨中矢状面用 tdTomato 荧光可视化。即使没有解剖，内淋巴囊也很容易看到。分离胚胎第 16.6 天以及出生后第 5 天和第 30 天的小鼠内耳。

在较高放大倍率下观察到内淋巴囊。对于 P30 小鼠，由于内淋巴管包裹在骨骼中，因此难以分离。用抗 SLC26A4 抗体和鬼笔环肽标记研究 E16.5 和 P5 完整内淋巴囊的免疫组织化学。

鬼笔环肽用于突出内淋巴囊及其周围的结膜组织。P5 处开放的内淋巴囊上皮的高倍率图像显示，标记为绿色的SLC26A4位于细胞亚群的顶端区域。尝试此程序时要记住的最重要的事情是要非常轻柔，以免损坏内淋巴囊。

通过这种方法分离的固定内淋巴囊组织可用于原位杂交、RNA 范围和免疫组织化学。活组织可用于制备用于转录组分析和生理学的 RNA。这种方法已被用于研究内淋巴囊的转录组，无论是作为一个整体还是在单细胞 RNA-seq 分析中，都有助于表征其不同的细胞类型。