使用新型机器人系统 Spotiton 进行时间解决研究的低温电子微观网格准备

使用Spotiton机器人系统，人们可以在90毫秒内与电子显微镜网格上的相互作用伙伴混合并使感兴趣的蛋白质变色。此协议允许捕获过于瞬息万变的中间蛋白确认，而标准网格制备技术无法捕获这些确认。时间解决Spotiton可以通知亚秒生物或生化系统，如膜通道活化，DNA或RNA合成，或药物或抗体与其目标蛋白的早期相互作用。

用户必须同时管理直接影响网格质量的多个组件。在使用之前了解系统并耐心准备网格非常重要。首先，打开氮气供应罐上的主阀，确保系统储层充满脱气超纯水。

打开多插座电源条上的计算机和 Spotiton 系统。单击桌面图标以打开 Spotiton 软件的用户界面。在工具菜单中，选择初始化阶段来初始化和将三轴机器人和旋转分配器头组件放回家，确保分配器提示在初始化和归入之前指向下。

在主菜单上，单击"前往安全位置"将机器人发送到安全位置。在吸气标签上，选择 Prime 将分配器头多次冲洗到水库中的水中。继续，直到两个不间断的水流可以看到从尖端出现。

在检查选项卡上，将提示一发送到检查摄像头并测试火水，调整振幅，直到产生离散液滴。按上部摄像机监视器中的"记录"按钮以录制一次发射提示的视频。将提示二发送到检查摄像机。

播放右侧监视器中提示一点射击的视频，同时在上部摄像机监视器中播放提示一射击的视频，与两个分配器的滴流生产模式相匹配。使用提供的 Allen 密钥从网格机器人的安装件中取出钳子。在附近的台面上，将测试网格纳米线侧放在网格块的边缘。

小心地抓住网格的边缘，并正确地将其放置在钳子中。然后重新安装钳子。在 Cryo 选项卡上，单击"提示到相机"，将提示一移到上部俯冲路径摄像头的视图区域，确保在上部摄像机监视器中选择 Live。

打开并调整上部摄像机灯。通过单击监视器内的鼠标，在上部摄像机监视器中显示一个位置提示。单击"网格到相机"以将网格定位在上部摄像机前，然后在需要时再次调整一个位置的尖端。

在 Cryo 选项卡上，确保未选择 Vitr 化网格，单击队列目标，然后点击 Plunge。评估上下图像，以确认分配器正常工作。将两个样品稀释到所需的浓度与适当的缓冲，理想情况下，使用相同的两个，并填补低温碗液氮。

等离子体使用五瓦氢和氧气清洁三到四个纳米线网格，并以1.5分钟为起点。插入雾化器并观察蒸汽从雾化器盖的中心端口退出。在主窗口中观察实时湿度监视器，或在"报告"和"环境"下打开环境湿度跟踪器。

检查房间和遮罩区的湿度水平。将每个样品的五微升添加到样品杯中。将样品杯装入托盘中，样品在左侧为提示一，右侧为提示二。

然后将托盘推回机器，直到它坐下。在吸气选项卡上，选择三个微升，以便每个尖端吸气体积。确保样品托盘已安全就位，单击吸气器，并观察移液器阶段将分配器头移入样品杯中。

通过取出样品杯并观察液体水平下降来验证两个样品的成功愿望。在检查选项卡上，将每个提示发送到检查摄像机以确认畅通无阻的配药。根据需要调整振幅，以匹配每个尖端的滴状。

将新鲜等离子清洁的网格加载到钳子中，但尚未安装钳子。确保湿度提升到约 90 至 95% 填充乙烷杯，并在检查摄像头前对两个尖端进行最后的测试，确认没有阻碍。在 Cryo 选项卡上，单击"相机提示"。

检查乙烷杯。如果乙烷冰已经形成，则根据需要用额外的乙烷气体融化。将带网格的钳子安装到网格舞台上。

在 Cryo 选项卡上，单击"网格到相机"，确保提示一端正确定位在上置摄像机监视器中。单击"已电气化网格"、队列目标，然后单击"俯冲"。当提示命令网格机器人将网格从乙烷跳入液氮并释放到水下搁板上时，单击"确定"。

检查网格的图像，以决定是应保留还是丢弃网格。如果保持网格，预冷细尖钳，轻轻抓住网格的边缘，并把它放入一个网格框插槽，从槽左侧的第一个插槽开始，顺时针前进。使用实验查看器通过选择报告和实验来查看和比较来自上下摄像机的网格图像以及暴跌时的机器设置和湿度测量。

此处显示在单个时间解决 Spotiton 会话期间准备的网格图像，通过将 RNA 聚合酶混合在 105 个碱基对 DNA 寡聚物中，在病毒化之前携带一个促进器序列 150 毫秒。在六个网格中，只有一个显示次优的恶芯。在有光的网格上沉积冰的模式与上部摄像机图像中看到的沉积液体模式非常吻合。

混合样品的有效排芯沿纳米线覆盖的网格条进行，样品很少溢出到与其着陆的方块相邻的正方形中。在充满冰的正方形中，冰通常最厚，在广场中央的孔内，在靠近网格条的孔中变得更薄。紧邻网格条的孔通常空着，因为靠近纳米线。

适当准备和处理纳米线网格将确保混合样品网格的冰厚度良好。Spotiton 系统还允许用户将两个样本单独存放在单个网格上，从而能够在同一网格维护会话期间收集未混合的控件。斯波蒂顿能够实时捕获细菌基因表达中的第一批中间体。

因为它们形成于次秒时间尺度上，因此它们的结构至今还不得而知。