颗粒模板化乳化可实现无微流体液滴检测

与定量 PCR 相比，数字液滴 PCR 可提供更高的准确性和灵敏度。这是一种简单的数字液滴PCR方法，需要最少的设备，不需要专业知识。颗粒模板化乳化是一种无微流体的乳化方法，不需要任何专门的设备。

此外，乳化在几秒钟内发生，并扩展到容器体积。对于商业微珠，在50毫升锥形管中加入0.5克与颗粒模板乳化或PTE兼容的干燥聚丙烯酰胺颗粒到30毫升无菌水中，并充分混合。在室温下孵育30分钟。

对于微流体制造珠子，将一毫升光刻胶倒在三英寸硅片的中心，然后以500 RPM旋转30秒，然后以1250 RPM旋转30秒。将晶圆放在设置为95摄氏度的电炉上15分钟以蒸发溶剂。用盖玻片将光掩模固定在硅晶圆上，并将晶圆暴露在准直的UV LED下2.5分钟。

将晶圆放在设置为95摄氏度的电炉上五分钟，以便在曝光后烘烤。通过将光刻胶硅片浸入100%PGMEA浴中长达15分钟来显影。用新鲜的100%PGMEA冲洗晶圆，然后用100%异丙醇冲洗。

风干晶圆，然后在设置为95摄氏度的电炉上干燥一分钟，然后将其放入干净的三英寸培养皿中。以10:1的比例混合PDMS硅基和固化试剂，然后在真空下使用干燥器对混合的PDMS进行脱气，直到没有气泡可观察到。将脱气的PDMS倒入培养皿中，确保硅片完全浸没。

对硅晶圆和PDMS进行脱气，然后将硅晶圆放入设置为65摄氏度的烘箱中至少60分钟，以固化PDMS。使用手术刀切除培养皿中含有微流体特征的PDMS块。使用0.75毫米活检打孔将入口和出口打孔到PDMS块中。

然后通过重复应用去除任何灰尘和颗粒，并将包装胶带去除到块表面。用100%异丙醇冲洗载玻片，然后风干表面，清洁载玻片。等离子体使用等离子体键合器用一毫巴氧等离子体处理载玻片和PDMS一分钟。

通过将等离子体处理的PDMS与特征朝下放置在载玻片上，等离子体处理的一面朝上，将PDMS贴在载玻片上。将载玻片放入设置为65摄氏度的烤箱中至少30分钟，以完成粘合。用氟化表面处理所有微流体通道，以确保表面疏水性，然后在65摄氏度下烘烤设备至少10分钟。

将聚丙烯酰胺（PAA）和氢氟醚（HFE）含溶液注射器装入注射器泵中。使用聚乙烯管将两个注射器连接到微流体装置。运行液滴生成装置，在15毫升的收集管中收集一毫升液滴，然后在室温下孵育三小时以进行聚合。

孵育后，通过移液除去下层油。将一毫升20%PFO的HFE油加入15毫升收集管中作为化学破乳剂。混合后，以2000×g离心15毫升收集管，持续两分钟。

通过移液去除底层，然后再次重复该过程。将两毫升己烷中的2%脱水山梨糖醇单油酸酯加入15毫升收集管中并涡旋。以3000×g旋转管子三分钟，并通过移液除去上清液以除去表面活性剂溶液。

重复此步骤两次。加入五毫升TEBST缓冲液并充分混合，然后以3000×g旋转三分钟，并通过移液除去上清液。重复此操作三次，然后重悬于五毫升TEBST中。

通过将6000×g离心一分钟以沉淀颗粒，制备用于颗粒模板化乳化的聚丙烯酰胺颗粒。然后通过移液除去上清液，并将沉淀重悬于无菌水中。重复三次，以确保去除任何残留的TEBST。

如文本手稿中所述，使用PCR预混液，适当的引物和荧光素水解探针，在新鲜的15毫升离心管中制备分散相。在室温下孵育五分钟，使用管旋转器轻轻搅拌。以6000×g离心分散相一分钟，并除去上清液。

将一微升酿酒酵母基因组DNA加入沉淀中，并通过移液或剧烈敲击彻底混合。在HFE油中加入200微升2%氟表面活性剂到管中，用于乳化。通过移液或敲击管子来移出沉淀，然后在3000 RPM下涡旋30秒。

让乳液沉降一分钟，然后除去100微升的底部油相，并用HFE油中新鲜的2%含氟表面活性剂代替该体积。轻轻翻转管子几次以混合。重复此操作三次或更多次，直到去除小卫星液滴。

沉降两到五分钟后，取出底部油相。用氟碳油中的5%含氟表面活性剂代替此体积。将100微升样品移液到200微升PCR管中，然后将PCR管放入热循环仪中。

将样品移液到计数载玻片上进行荧光成像，并对样品进行成像。颗粒模板化乳化提供卓越的单分散性。随着过量上清液的除去，加入稳定的表面活性剂，并对样品进行涡旋以生成乳液。

所得液滴由颗粒核心和水性样品组成，含有反应所需的试剂和样品分子或细胞。带有模板颗粒的多分散液滴表明涡旋不足。另一个问题是产生过多的卫星，这会降低封装效率。

卫星应不超过封装样品总量的10%。它们可以通过用新鲜油洗涤从乳液中清除。当含有扩增靶标的液滴变成荧光时，PTE的效用可以在数字PCR中得到证明，从而允许直接定量靶标。

当靶标很少见时，荧光液滴产生很少的阳性，而当它丰富时产生许多阳性。这些结果可重复使用市售聚丙烯酰胺颗粒，从而在相同范围内实现精确测量。从分散相中去除上清液对于样品封装非常重要。

了解沉淀和上清液的体积可以帮助识别两者之间的界面。如有疑问，请错误地去除上清液。