用于从单一DNA分子大规模平行蛋白质合成的Femtoliter滴体阵列

在手指大小的基材上生产出超过一百万个均匀液。单个DNA分子随机分布到每个液滴中。蛋白质产量与液滴中分子的数量成正比。

我们的技术可用于酶活性的快速定量测量，无需复杂的蛋白质表达和纯化。首先，在染色架上设置盖玻璃，将机架放在八个氢氧化钠中。在室温下对盖玻璃和染色架进行声波化 15 分钟。

从氢氧化钠中去除染色架，用水冲洗盖玻璃 10 次。用气枪擦干盖玻璃。然后在200摄氏度的热盘上烘烤和干燥盖玻璃5分钟。

准备0.05%氨基硅烷溶液。将盖玻璃浸入此溶液中，并在室温下孵育一小时。用纯水冲洗盖玻璃五次。

然后用气枪擦干盖玻璃。在80摄氏度的热盘上烘烤5分钟。将盖玻璃基板放在旋转涂布机的定制真空夹头上。

在玻璃基板的中心分配 70 至 90 微升的 A 型 CYTOP 聚合物。然后立即旋转涂层聚合物。初始聚合物涂层损坏了最终微记阵列的质量。

将聚合物分配到盖板玻璃的中心，而不引入气泡。将涂层玻璃放在角落，放在铝箔上。在80摄氏度下烘烤30分钟，然后在200摄氏度下再烘烤一小时。

在基板中心分配 0.2 至 0.3 毫升光附剂。立即以 6，000 rpm 转速旋转光圈，持续 60 秒。使用乙醇浸泡的湿巾从基材边缘去除多余的光质。

在110摄氏度下烘烤基板5分钟。要对光膜进行补水，让基板在相对湿度为 42 至 60% 时站立 30 分钟，将基板加载到掩码对齐器中，并在真空接触模式下将其暴露 25 秒。然后将基板浸入开发中五分钟，溶解暴露的光膜。

使用纯净水冲洗基材10次。然后用气枪彻底干燥基材。将基板放在反应离子蚀刻机的反应室中，用氧等离子体蚀刻光敏覆盖CYTOP。

蚀刻后，在室温下用丙酮对基板进行五分钟的声波化，去除剩余的光刻影。然后将基板声波化为丙醇五分钟。如手稿所述，使用纯水再次冲洗、声波化和冲洗基材。

然后用气枪擦干基材。使用台式切割机，将双涂层胶粘剂 Kapton 薄膜胶带切割成定义的微通道形状。将切割的胶带粘在扁平的培养皿底部，作为 PDMS 成型的主菜。

将 PDMS 混合物倒入胶带图案的培养皿中。然后将培养皿放入迷你真空室中，将 PDMS 混合物脱吸一到三个小时。然后将培养皿放在60摄氏度的烤箱中，并过夜以固化PDMS。

PDMS 固化后，从培养皿中剥离固化的弹性体，并使用平电缆切割机切出 PDMS 微通道块。然后在每个微通道的每一端打一个洞。先前准备的基板将有一个微记阵列区域。

将 PDMS 微通道放在基板的这一部分。然后将 200 微升移液尖端插入 PDMS 微通道中的一个孔中。首先，在PCR管中准备CFPS反应溶液。

然后，使用200微升非滤芯液尖，绘制出10微升的溶液。将移液尖端插入 PDMS 微通道的入口孔，然后向下推移管柱塞，直到溶液从微通道出口溢出。将 FemDA 设备转移到预冷却的铝块。

确认微室阵列区域快速从半透明变为透明。抽出 300 微升预冷却冲洗油，并立即将油转移到微通道进气孔的移液尖端。冲洗油进入微通道，挤出位于微室外的多余的反应溶液。

同时从设备中卸下两个插入的移液件尖端。立即将设备从铝块移动到石蜡薄膜。将装有密封油的准备好的移液尖端插入 PDMS 微通道的入口，然后注入油，直到油从出口溢出。

女性石滴被油密封在单独的微容器中。打开散焦的 BF 图像。要从每帧中删除平滑的连续背景，请从"过程"菜单中选择"减去背景"。

滚球半径输入 20。选中"预览"框并选择"确定"。当被问及是否处理所有图像时，请选择"是"。

接下来，要降低噪音，请选择"过程"、"过滤器"和"中位数"。输入半径的 2.0（以像素为单位）。选中"预览"框并选择"确定"。

当被问及是否处理所有图像时，请选择"是"。接下来，选择"图像"，"调整"，"阈值"，将微记器的图像与图像背景分开。从插件菜单中，选择 FemDA，FemDA 分析。

输入单个微室的近似最小和最大像素数。微记器的预期最小和最大循环度以及开始帧和结束帧号，然后选择"生成 ROI"以检测微记器。已成功检测到的 ROI 显示在弹出式菜单 ROITable 中。

在 FemDA 分析窗口中，选择"应用 ROI 蒙版"。检查图像以查看微记器是否被正确检测到。打开荧光图像，并把它带到前面。

再次单击"应用 ROI"蒙版可将 ROI 添加到荧光图像。在 FemDA 分析窗口中，选择"一次拍摄"以分析图像终点数据。输入顶部像素数的 N，使用每个 ROI 的高端像素来计算相应液滴的均值强度。

然后单击"测量强度"以计算所有检测到的液滴的均值强度。ROITable 使用荧光图像中的新数据进行更新，直方图将显示在新窗口中。单击"保存为文本"按钮导出数据。

荧光溶液封装在FemDA微腔中，使用显微镜测量了与液滴大小相关的荧光强度。发现液滴的分布较窄。从共体显微镜重建的 3D 图像还显示了一段时间的一致液滴大小。

液滴在室温下稳定，至少24小时不蒸发或液滴交叉污染。荧光蛋白 mNeonGreen 在 FemDA 中合成。借助并发散散焦亮场图像对堆栈图像数据进行了分析。

由于每个液滴的荧光强度是测量其蛋白质产量的，直方图强烈表明每个液滴的DNA分子数量相等。含有不同数量的DNA分子的液滴的概率非常适合泊松分布。在FemDA中也进行了碱性磷酸酶的合成，每五分钟拍摄一次图像。

反应显示，在较早的时间点，液滴的荧光强度也出现了类似的谨慎分布，直方图结果证实液滴中DNA分子的数量不相等。封装在单个液滴中的单个 DNA 分子可以进一步恢复、放大和排序，从而使其具有最高的蛋白质筛选成为可能。一种具有小体积和高稳定性的液滴技术，可快速、准确地诊断具有特定生物标志物的癌症疾病。