类器官来源的单层概括患者的肠道上皮屏障功能，并允许测试旨在增强每个患者功能障碍的治疗效果，以确定个性化的治疗策略。类器官单层提供进入上皮顶侧的通道，这是发生损伤的一侧，并且在作为3D结构生长的类器官中是正常和可访问的。每个类器官都是不同的，因此斗争。
为了形成紧密的单层，在增殖阶段使用类器官并快速消化以形成两到四个细胞的簇。滴定每个模型的细胞接种。演示该程序将由HUB的高级研究助理Wies Van Dooremalen完成。
首先用细胞外基质或ECM涂覆膜插入物。在生物安全柜中工作，将膜插入物放入支撑板中。用钙和镁在冰冷的DPBS中稀释ECM 40X，然后将150微升稀释的ECM移液到每个插入物的顶端室中。
将板在37摄氏度下孵育至少一小时。为了制备用于接种的细胞，在37摄氏度的水浴中预热等分试样的细胞解离试剂。对六孔板的每个孔使用两毫升试剂。
将含有类器官的培养板从培养箱转移到生物安全柜中。按照文本手稿中的描述处理类器官，但不要将多个管子合并为一个管子。收获类器官后，将基础培养基或BM加入12毫升，并以85倍G离心，然后吸出上清液。
用高达12毫升的DPBS填充含有类器官的管子，然后使用10毫升移液器上下移液10次。在8摄氏度下以85倍G离心5分钟，并在不干扰类器官沉淀的情况下吸出上清液。将预热的细胞解离试剂加入类器官中并重悬于它们，然后将试管对角线或水平孵育在37摄氏度的水浴中孵育五分钟。
孵育后，使用5毫升无菌塑料移液管或P1000移液器上下移液10次。在显微镜下检查类器官悬浮液，看看是否已经形成单细胞和由两到四个细胞组成的一些细胞团块的混合物。通过将高达12毫升的BM与ROCK抑制剂添加到细胞悬浮液中来阻止细胞解离。
离心细胞，然后吸出上清液而不干扰细胞沉淀。当在几个管中处理相同的类器官培养物时，将细胞沉淀池化，然后将其重悬于12毫升BM中。通过用BM预润湿的40微米过滤器过滤细胞悬浮液，并将流过物收获到50毫升锥形管中，然后用10毫升BM洗涤过滤器并将流出物收获到同一管中。将过滤的细胞悬浮液转移到两个新的15毫升锥形管中，并重复离心。
在不干扰细胞沉淀的情况下吸出上清液，并将细胞重悬于四毫升IEM中，每个全培养板补充10微摩尔ROCK抑制剂作为起始材料。将少量细胞悬浮液与台盼蓝一比一的比例混合进行计数，然后计数细胞并计算活细胞的总数，以小团块计数每个单独的细胞。准备含有3X 10至每毫升IEM的第六个活细胞的细胞悬浮液，并补充10微摩尔ROCK抑制剂。
要接种细胞，请小心地从ECM包被的插入物中吸取DPBS，使板保持水平。将800微升补充有ROCK抑制剂的IEM移液到每个基底外侧隔室和150微升制备的细胞悬浮液滴落到顶端隔室的ECM包衣膜上。将板置于37摄氏度和5%二氧化碳的培养箱中。
一旦细胞沉降到膜上，每天测量经上皮电阻或TEER，并使用显微镜对膜插入物进行成像。要刷新单层，从含有膜嵌件的板的基底外侧隔室中取出培养基，然后小心地从顶端隔室中吸取培养基。向每个顶端隔室滴加150微升新鲜IEM，并向每个基底外侧隔室添加800微升新鲜IEM。
如果使用手动TEER计，请用70%乙醇清洁电极，并在生物安全柜内风干，然后将电极放入含有BM的管中。将电极连接到手动 TEER 仪表，然后打开功能开关以测量欧姆，然后打开电源开关。将短电极放在插入物的顶端隔室中，将长电极放在基底外侧隔室中，而不接触单层。在空白孔中测量电阻，然后在其余样品中测量电阻。
在具有不同条件的样品之间用BM洗涤电极。完成后，用半水和70%乙醇清洁电极，然后风干。该方案用于收获肠道类器官和制备上皮细胞的单层。
这里显示了在IEM中培养八天的单层。当将单层暴露于肠细胞分化培养基或EDM时，可以观察到结构，而暴露于组合培养基或CDM的单层显示出更平滑的结构。定量测定单层形成，然后测量TEER。
完全融合的单层具有约100欧姆平方的TEER值，当暴露于任一分化介质时，其增加。所有介质条件下的单层对路西法黄的表观渗透性较低。在IEM中培养的回肠单层的溶菌酶分泌高于在IEM中培养的单层，直到汇合，并在EDM或CDM中再培养四天。
在IEM，IEM和随后的EDM或IEM和随后的CDM中培养的单层显示出形态学的差异，这在H&E，Ki67，MUC2和Alcian Blue染色中观察到。分化后，增殖细胞减少，而杯状细胞和肠细胞标志物基因表达与EM条件下观察到的相比增加，如LGR5，MUC2和碱性磷酸酶基因表达所示。在制备单层时，重要的是在消化它们后防止类器官中的无油酸。
此外，细胞中的ECM应均匀分布在透孔膜上。类器官衍生的单层允许以患者特异性方式使用不同的荧光底物评估分子运输。
