从小鼠中分离心肌细胞的安特格拉德灌注方法

我们开发了一种简单的无兰根多夫方法，通过前代包装技术分离出单个鼠标心脏细胞。这种方法允许将心脏细胞从幼鼠分离到老年小鼠。兰根多夫逆行灌注被认为是分离各种实验动物心脏肌细胞的黄金标准。

然而，LTA的精制在技术上是困难的小鼠，因为他们的小尺寸。对于小鼠心脏的收获，在确认安乐死和剃须腹部后，迅速打开胸腔，露出心脏，并使用塑料转移移液器，将尖端切成大约心脏大小，将心脏吸入移液器中。举起移液器，创造足够的空间插入弯曲的剪刀，并使用剪刀从后侧小心切除心脏，以避免损坏腹腔。

立即将心脏放入含有冰冷 CIB-EGTA 的 30 毫升玻璃烧杯中约一分钟。当收缩停止时，将心脏放在含有冰冷CIB-EGTA的35毫升培养皿中，并去除肺和其他可见组织。将大致清洁的心脏放在心脏支架上，里面装满了冰冷的 CIB-EGTA 顶点侧面，并将支架置于立体显微镜下。

从主动脉周围取出脂肪和结缔组织。如果切割主动脉的长度太长，修剪主动脉正下方的胸动脉，并定向心脏，使前表面朝前方。使用钳子抬起主动脉的末端，并使用一个小血管夹夹夹紧阿特里亚附近的主动脉，同时轻轻地向下推下主动脉。

然后将夹紧的心脏放在灌注板上，前侧朝上，用几滴 CIB-EGTA 滋润心脏。对于前额灌注，将含有预热 CIB-EGTA 的 20 毫升注射器装载到柔性延长管和有标记的注射针到输液泵上，以每分钟 0.5 毫升的流速启动泵。当针头和泵被填充后，将注射针放在灌注板上，前面对角线形状的较短侧，然后滑动针头，直到它只是触摸心脏的顶点。

小心地将左心室顶点附近的针头插入心室，而不会将针头从板上扭动或分离，观察标记以估计针头插入的深度。当针头插入完成时，血液应该开始从冠状动脉流出。使用胶带将注射针固定在板上，并将泵速提高到每分钟一毫升。

如果心脏被成功灌注，毛细管中的缓冲液的流动应该在史诗下面可见。经过两到三毫升的CIB-EGTA灌注后，用酶混合物代替灌注缓冲器。灌注一到两毫升后，将泵速提高到每分钟 1.5 毫升。

使用移液器去除从心脏流出的积血香水，并在香水总积达到10毫升时停止灌注。在灌注结束时，将10毫升的酶混合物从注射器转移到加热垫上的60毫米培养皿中，并在菜中加入20毫克BSA。轻轻旋转盘，溶解粉末，从心脏取出注射针和夹子。

从心脏取出心室和心室，并将组织放入BSA补充的酶混合物中。要隔离心室肌细胞，使用两对钳子来抓住心室，轻轻地将心室拉成小块。当所有心室碎片都产生时，用温和的管道将细胞分散约30次，并通过100微米网状细胞过滤器过滤未消化的碎片，进入15毫升离心机管。

离心后，在预热 CIB 中重新放活心肌细胞颗粒，补充钙和 BSA，并在 37 摄氏度下孵育细胞 5 分钟。在孵化结束时，再次将细胞离心，并以适量的细胞再悬念溶液中恢复沉淀的心肌细胞，以维持在37摄氏度，直到下游分析。为了分离心肌细胞，将腹腔转移到预热 CIB 的容器中，并补充钙和 BSA，并如所示将腹腔撕成碎片。

使用设置为 10 微升的 20 微升移液器，通过管道干扰组织，并通过离心收集分离的细胞。然后以适当数量的细胞暂停溶液中恢复腹中细胞。在此图像中，可以观察到刚分离的心室肌细胞。

这种隔离程序可在隔离后大约5小时内将8至10周大的8至10周大小鼠的棒状静默心室肌细胞产生70%至80%的产量。在两岁以上的小鼠中，新分离的活细胞比例较低。心室和心室肌细胞中记录的动作潜力与兰根多夫方法获得的细胞中测量的动作潜力相似。

免疫学分析可用于评估心室肌细胞肉瘤结构的组织以及亚文化后心脏成纤维细胞转化为肌纤维细胞的转化。建议进行西式斑点分析，以确定加工后对阿特里亚和心室感兴趣的蛋白质的具体表达。与酶灌注后，来自阿特里亚和心室的蛋白质可以很容易地在裂解缓冲中均质，具有提取蛋白质的轻量力。

控制针插入的方向和深度很重要。将针头插入左心室时，注意不要刺穿心室隔膜或穿透瓣膜。您可以根据实验的目的更改香水的成分。

例如，EGTA 补充洗涤剂可用于制造心脏无细胞支架。