许多怀孕在七、八个受精后人类胚胎发育的早期失败。该协议为调查人员提供了在这个神秘的植入窗口中体外生长人类概念体的机会。这使我们能够了解支撑人类植入成功和早期胎盘形成的机制。
利用扩展的培养系统在体外生长植入阶段人类胚胎可能是获得真实材料研究植入和早期成体细胞分化的唯一方法。这种简单的技术是一个强大的工具，使我们能够回答许多有关人类早期发展的基本问题。使用本协议进行的研究将在很大程度上有助于了解早孕损失、反复植入失败和胎盘病理。
演示这个程序的将是迪尔德雷·洛格斯登，一个实验室的博士生。胚胎变暖前一天，在无菌层流罩中准备介质和恢复板。用 10% SPS 填充两个中心井器官培养洗盘，用 500 微升 BM，然后用 500 微升的胚胎培养等级油覆盖 BM。
在16毫米组织培养皿中，8毫升胚胎培养油层和锚定20微升BM滴，底部有10%的SPS。在37摄氏度、6%二氧化碳和5%氧气的培养箱中平衡洗碗液和回收板，至少4小时。将 IVC 1 的大约 4 毫升放入五毫升卡扣管中，并准备一个带 500 微升 IVC 1 的洗涤盘，无需油覆盖。
将培养箱中的菜和管子平衡至少四个小时。在PBS中从人血清中稀释纤维素至每毫升30微克。打开八孔室盖玻片包装，注意不要接触井，然后轻轻地移液器250微升的纤维素进入每口井。
更换盖玻片上的盖子，在 4 摄氏度下孵育 20 至 24 小时。在胚胎变暖的早晨准备扩展培养板。用纤维素取回室盖滑，并放在层流罩中。
然后用一毫升移液器去除纤维素混合物并丢弃它。将平衡的 IVC 1 的移液 300 微升进入每个井，将盖玻片放入孵化器，直到去除 Zona pellucida。在D5人类胚胎的加热和恢复后，评估它们重新膨胀，并拍摄每个胚胎的照片。
将每个胚胎移动到 5%FCS 缓冲处理介质的 500 微升。然后像文本手稿中描述的那样用酸性泰洛德的溶液来对待它。立即将胚胎与溶解的佐纳移动到300微升加热的莫普缓冲介质，以淬火泰洛德的溶液。
然后将胚胎移动到中央井器官组织盘中，在胚胎培养品位油下含有10%SPS的均衡BM。然后将胚胎返回20微升恢复滴。使用平衡的 IVC 1 介质将胚胎单独移动到洗碗盘，然后小心地将每个胚胎移动到室盖玻片的井中，确保跟踪胚胎鉴定。
将室盖玻片返回到37摄氏度、6%的二氧化碳和大气氧气的孵化器两天。在第二天，仔细检查胚胎在显微镜下的附着，并交换介质。通过轻轻敲击盘子，知道哪个胚胎附着在盘子上。
要更换介质，请取下盖子，小心吸气 150 微升 IVC 1，注意不要打扰所附胚胎。如果胚胎尚未附着在板上，请勿更换介质，因为 IVC 1 中的血清有助于附着。缓慢移液器 150 微升的均衡扩展培养基，IVC 2 进入每个井，并更换盖玻片上的盖子。
小心地将室盖玻片返回到孵化器。每天重复介质交换和附件检查，直到胚胎准备好固定或单细胞消化。如果需要收集已用介质进行进一步分析，请将去除的 IVC 1 的 150 微升卡冻结为无菌低束束 0.5 毫升管中。
用200微升PBS清洗每个胚胎一次，然后向每个井中加入200微升的三辛解。将室盖玻片返回孵化器五分钟。使用小移液器或细拉嘴移液器拾起单个 MTB，然后使用较大的移液器通过上下吸气轻轻地分离胚胎。
继续用直径较小的移液器尖端轻轻地反复吸气胚胎，直到胚胎在三辛中总共孵育10分钟。要进行单细胞选择，在胚胎培养油下通过320微升洗涤PBS和0.1%PVP的分离细胞，注意不要丢失任何细胞。洗涤后，使用精细拉玻璃移液器选择一个细胞。
小心地将单个细胞移液到无菌的 0.2 毫升低结合管中，用最小容量的 PBS 和 PVP。在液氮中捕捉无自由单细胞，并将其储存在负80摄氏度，供进一步使用。健康的胚胎在扩展培养过程中继续扩散，而异常胚胎开始从外边缘缩回并解体。
在受精后的第8天，胚胎中的大多数细胞是细胞萎缩细胞或CTB，对成体细胞标记GATA-3呈阳性。在胚胎的外围，CTB已经区分为多核同步细胞，有一个像外观和染色阳性的人类CGB的表。在第10天，CGB阳性候虫细胞的形成达到最大值，这一点得到了此时HCG生产激增的证实。
对HLA-G有阳性的移栖细胞也开始出现，并远离胚胎体。到了第12天，STB分化正在下降，MTB的产生变得更加突出，这表明重点从第10天的激素生产转移到第12天的细胞迁移。这些变化可以在近植入期的时间推移视频中观察到。
该视频演示了爆炸球的崩溃、STB 的形成以及 MTB 的最终分化和迁移。完成此过程时，要记住的最重要的事情是，您正在使用对温度、渗透性和 pH 值变化敏感的活胚胎。尽量减少盘子离开孵化器的时间对于维持胚胎健康至关重要。
完成此程序后，研究人员可以使用分离的单细胞进行下游单细胞组理测定，如单细胞RNA测序和全基因组双硫拟合测序，以更好地了解人类植入和早期胎盘形成期间的表观遗传和转录变化。
