脑毛细管中培养细胞细胞钙测量和钙成像研究

这是一种简单而有效的方法来隔离和培养原脑环状物，用于研究细胞间钙信号。获得的细胞培养物是近同质的中白细胞种群，加载膜状物进行钙成像非常简单。这里描述的方法应该为该领域的其他研究人员提供强大的工具，用于研究腹膜生物学，以及体外腹膜内信号。

首先在37摄氏度的水浴中解冻一小瓶毛细管。毛细管解冻后，将它们转移到具有 30 毫升 DMEM 复合剂的离心管中，并在 500 倍 G 下将其离心 5 分钟，然后从管中取出介质，并在 10 毫升新鲜 DMEM comp 中重新悬挂调色板。将悬浮液转移到涂有涂层的 T-75 烧瓶中，让毛细管在 37 摄氏度的培养箱中粘附在底部 4 到 6 个小时，孵化器提供 10% 的二氧化碳。

孵育后，在光学显微镜下检查烧瓶。毛细管的分馏现在应该附在烧瓶的底部。在播种毛细管后的第四天，在显微镜下检查它们，以确保它们大约为 60 到 70% 的汇合。

吸气介质，用PBS轻轻清洗细胞。加入两毫升解冻的三辛-EDTA，将烧瓶留在培养箱中一至三分钟，经常将烧瓶中取出，用显微镜观察细胞分离。当内皮细胞开始四舍五入时，轻轻敲击烧瓶将其分离。

当细胞分离时，通过向烧瓶中添加 10 毫升 DMEM 复合剂来停止尝试性。用介质冲洗烧瓶几次，并吸入内皮细胞悬浮液，现在可用于其他目的。在烧瓶中加入10毫升DMEM复合物，并在光学显微镜下检查，以确保心状物仍然存在并附着在底部。

然后，将烧瓶放回孵化器，让富含字节的培养者生长。要将膜覆盖的 96 孔板中播种，请将它们分离，如文本手稿中所述。吸气介质，注意不要干扰细胞颗粒，并在一毫升新鲜DMEM复合中重新悬浮颗粒。

使用计数室计算细胞，然后计算每井应添加到每个井的悬浮量，以每井播种 10，000 个细胞。添加细胞悬浮液，然后向细胞添加足够的DMEM复合，以达到每孔200微升的总体积。当准备用 Fura-2 AM 钙指示器染料加载心状物时，将 96 孔板与细胞一起从培养箱中取出，然后从孔中吸出介质。

用测定缓冲液清洗细胞两次，并在每井中加入100微升的装载溶液。用锡箔包裹盘子，以避免照片漂白，并在室温下孵育45分钟，30 RPM摇动。孵育后，吸气缓冲液，用测定缓冲液洗涤细胞两次。

将100微升新鲜剂加入检测缓冲液，让细胞孵育30分钟。孵育后，将板读卡器的温度设置为37摄氏度，将带细胞的96井板转移到样品板位置，然后将带激动剂的试剂板放在试剂板位置。首先测量电池的负载，以确保 Fura-2 AM 在所有孔中负载相等，然后在 340 至 380 纳米时以激发荧光波长进行测量，在 510 纳米时执行发射波长。

加入50微升的激动剂，以150微升/秒的速度，从试剂盘到每一个带细胞的井。将盖板插入电池室，然后拧紧，以避免泄漏。将 DMEM 复合和计算的细胞悬浮量添加到每个腔室中，最终体积为 500 微升。

在37摄氏度和10%的二氧化碳下孵育细胞室6天，或直到汇合。一旦细胞汇合，将细胞室从培养箱中取出，并吸气培养。用测定缓冲液清洗细胞两次，在每个腔室中加入500微升的加载缓冲液，然后在室温下孵育45分钟。

孵育后，吸气缓冲液，用检测缓冲液清洗细胞两次，然后在每个腔室中加入500微升新鲜检测缓冲液，并在室温下再孵育30分钟，使 AM 酯的裂解。用 500 微升新鲜测定缓冲液更换缓冲液，并在共和显微镜下进行实时成像。尽可能轻轻地将细胞室安装在显微镜的舞台上，以避免细胞受到干扰。

将激励波长设置为 488 纳米，发射为 515 纳米，以 5 秒间隔进行 2 分钟顺序图像采集，将 x，y 图像大小设置为 512 x 512 像素。向细胞室添加 300 微升 100 毫摩尔 ATP，然后启动图像采集。该协议用于净化牛脑毛细血管的胸毛。

在九天中，从种子毛细血管中生长的细胞生长被成像出来。毛细管在第一天完全附着在烧瓶上，第二天，内皮发芽是可见的。四天后，细胞外生长明显，内皮细胞通过三位一体机切除。

毛细管的残余物在试鸣后存在，但几天后从烧瓶中消失。去除内皮层后，允许内皮层生长至汇合。第九天，周利群岛达到约80%的汇合，形成岛屿。

将ATP添加到富拉-2加载的环状物导致细胞酸钙水平增加。反应发生在ATP加入过周后，并在测量的时间段缓慢下降。钙反应也测量与实时共体成像。

测量了基线荧光，然后在64秒内加入ATP，细胞内钙反应强烈。不久之后，细胞酸钙在细胞中分体化，细胞面积减少可见。到300秒时，细胞面积大减，荧光几乎降低到基线水平。

这种方法已被用于从原发性脑毛细管腹膜获得第一个细胞内钙测量，表明腹膜通过ATP刺激，并能够在体外收缩。