大肠癌HT29衍生癌症干细胞类肿瘤球中的驱动基因发现

我们的协议利用RNA-Seq和生物信息学工具快速发现过度表达的驱动基因，这些基因有助于形成茎样结肠直肠肿瘤球。该协议用于筛选不同表达的基因和信号通路，以研究选择性结肠直肠癌中癌症干细胞的分子机制。在培养的第七天，使用带数字细胞成像系统的倒置显微镜来观察和测量肿瘤球的直径。

当肿瘤球直径大于100微米时，用0.25%的胰腺素治疗培养。在37摄氏度下5分钟后，用生长介质体积的两倍中和尝试素，并使用血细胞计计算细胞。通过离心收集细胞。

并在每100微升中浓度的4个细胞中，以5倍10的量重新暂停颗粒。在每个管中加入两个感兴趣的原抗体微升，在室温下孵育细胞30分钟，每分钟200转。在孵化结束时，用900微升PBS洗涤每个管，并分析细胞，通过流动细胞学表达感兴趣的蛋白质，根据标准协议。

对于在胰蛋白酶采集后进行RNA分离，如刚刚证明的，每50微升PBS浓度将细胞重新以2倍10至第五细胞，用200微升的解液缓冲液将每个样品与每管两个微升的β·默卡托乙醇补充。在室温下短暂涡旋和五分钟孵育后，通过离心收集酸盐，并在每个管中加入200微升70%乙醇。将样品转移到快速柱中，通过离心去除溶剂。

用400微升的洗涤液一和600微升的洗涤溶液洗涤样品，通过离心彻底去除任何非RNA，然后在同一离心机条件下再离心两分钟，以去除任何残留乙醇。然后将颗粒重新浸入每管50微升蒸馏水中，将样品离心1分钟，然后收集含有超自然物质的RNA。在RNA测序分析后，研究肿瘤球细胞与亲肿瘤细胞的差别基因表达。

选择大于 1 到负 1 log2 折叠变化且读取计数大于 100 的基因在肿瘤圈和家长组中。并如前所述使用命令。获取火山图的数据，以确定差异基因表达。

在网络分析员中，对于驱动基因选择，选择单个基因输入并复制并粘贴所选的过表达基因，将人类指定为生物体，官方基因符号指定为ID类型。单击"上传"并继续。要使用蛋白质-蛋白质相互作用来插入和分析数据，在遗传蛋白-蛋白质相互作用之后，使用S STRING相互作用组数据库，其置信度分数被切断900，以显示种子基因。

交叉链接上传的基因。与更多单个基因相关的种子基因可以被选为驱动基因，这些基因可能参与维持肿瘤球的形成。在"布局"旋钮中的"背景图和强制图集"中选择"在映射概述中的白色"继续"。

然后选择豹基对来分析上调节基因组。直径大于100微米的肿瘤球在培养后7天内形成。流量细胞测量分析显示，与亲亲HT29细胞相比，HT29衍生肿瘤球中的LGR5和CD133表达增加。

RNA测序后，可以绘制出由热图确定的P值小于0.05的上、下调节值大于1对2倍的基因，以区分HT29衍生肿瘤球和亲亲HT29细胞之间的重要基因。在这个具有代表性的实验中，对超过1对2倍的上调节基因的分析产生了10个种子基因，将基因网络交叉连接。豹基对分析表明，两个基因与凋亡的负调控有关。

此外，通过定量PCR验证了所选基因在HT29衍生肿瘤球中的表达。差异基因选择是程序中最重要的步骤。请记住，使用大于 1 的 log2 折叠更改作为标准，重新计票大于 100。

使用此协议，从结肠直肠衍生肿瘤球中挑选的基因可以被击倒或过度表达，以发现它们在肿瘤球形成中的潜在作用。