使用激光切割模具实现简单的无光刻单细胞微模式

我们将介绍一种基于模具的无光刻无单细胞微模式方法，该方法克服了与光刻和软光刻相关的许多障碍。模具可重复使用，且过程低廉且可定制。该方法为非工程研究人员在各种生理和病理环境中研究细胞形状和面积诱发的机械转化开辟了一条新途径。

此外，该协议允许对数千个细胞进行微模型，这些细胞可用于培养皿中高通量药物筛选和疾病建模。视觉演示将促进植入两个关键步骤:从水凝胶分离盖玻片，在放置模具之前充分干燥水凝胶。如手稿所述，在新的 50 毫升丙烯离心管中准备聚丙烯酰胺水凝胶溶液。

接下来，准备5%光启动器溶液，将成分溶解在700微升100%乙醇中。成分不溶水，所以一定要完全溶解的漩涡。添加 300 微升 PBS，最终体积为 1 毫升。

在冰上工作，用冰冷DMEM F12介质或1X PBS稀释基底膜基质蛋白库存溶液，以优化稀释比。放在冰上供以后使用。使用地下室膜基质时，确保始终在冰上工作，并在冷冻移液器尖端和管中使用冰冷溶液。

将紫外线台灯放在生物安全罩中。接下来，将之前准备的灭菌石蜡薄膜放置。如果石蜡薄膜未完全干燥，请使用真空吸气系统去除任何残留液体。

使用自 <3>化钳子，在每个培养皿中，在石蜡膜上放置六个自 <3>自 <3>化盖玻片。为了准备UV交核多丙烯酰胺最终溶液，用聚丙烯酰胺水凝胶前体溶液稀释光启动器溶液。使用 50 毫升过滤装置对溶液进行灭菌，其孔径为 0.22 微米。

然后将 200 微升的 UV 交核多丙烯酰胺最终溶液分配到 Petri 盘中的六个玻璃盖玻片上。使用自动解吸钳，小心地用第二个盖玻片盖住每个盖玻片，在两个盖玻片之间捕获溶液的一层。将装有盖玻片的培养皿放在紫外线台灯下，盖子未关闭。

白纸覆盖在非白色表面上对尽量减少紫外线强度损失非常重要。为防止紫外线辐射，请用铝箔盖住灯。多丙烯酰胺水凝胶的光聚聚一体，可进行五分钟。

使用剃须刀刀片小心地分离每对盖玻片。用 PBS 填充包含六种水凝胶盖玻片复合材料的储液罐。冲洗五分钟后，将水凝胶盖玻片复合材料返回培养皿中的石蜡膜。

在零下80摄氏度的储存中获取一管S sulfo-SANPAH。将1，200微升预冷却PBS加入管子，通过上下移液混合。将稀释的 Sulfo-SANPAH 的 200 微升分配到 Petri 盘中的石蜡薄膜上。

将水凝胶盖玻片复合材料放在 Sulfo-SANPAH 上，水凝胶与 Sulfo-SANPAH 接触。接下来，将水凝胶盖玻片复合材料放在紫外灯下，并将其暴露五分钟，以激活 Sulfo-SANPAH。如果 Sulfo-SANPAH 从橙色变为棕色，表示激活和合并成功，请于 10 分钟内继续执行下一步。

用新鲜的 PBS 补充一次性聚丙烯储液罐。将激活的水凝胶盖玻片复合材料转移到储液罐中，并短暂冲洗，以去除未绑定的 Sulfo-SANPAH。将水凝胶盖玻片复合材料放在培养皿中的石蜡薄膜上，然后用无菌无绒湿巾小心地涂抹。

在每个水凝胶盖玻片复合材料的顶部放置一个模具。为确保模具和复合材料之间的密封紧密，使用自动清洁的无绒湿巾擦拭，去除多余的水分。小心地分配稀释的基底膜基质蛋白溶液，在每个水凝胶盖玻片复合材料上放置 200 微升。

在37摄氏度下过夜孵化结构。第二天，将复合材料转移到六井板。通过观察基质蛋白溶液是否保留在模具顶部，可以很容易地验证水凝胶和模具之间的紧密密封。

未能形成紧密密封会导致蛋白质溶液快速通过孔泄漏。将复合材料完全浸入 PBS 中。使用自 <3>化钳子，小心地将模具从水凝胶中分离，而不会撕裂水凝胶。

从油井中去除 PBS，用 DMEM 重新填充油井。在37摄氏度下孵育板。从培养箱中取出板后，检查 DMEM。

如果 DMEM 不是多云的，水凝胶盖玻片复合材料可用于细胞电镀。模具是制造出来的，包含方形和矩形数组。微表层水凝胶基板是从基质蛋白的模具和孤岛中创造的。

也获得细胞岛。例如，人类诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的岛屿。基质蛋白浓度在生成适当模式方面起着至关重要的作用。

最佳浓度导致蛋白质的均匀分布。次优基质蛋白溶液浓度导致模式不理想。使用模具的正面至关重要。

如果使用模具的背面，则由于激光切割的方向，基质蛋白岛的大小会增加。虽然使用模具的背面没有显著影响矩形图案的宽度，但高度显著增加导致预期纵横比降低。基于模具的图案应用于硅弹性体基板。

硅弹性体基板上的图案心肌细胞在低放大率下通过心脏肌蛋白T的免疫细胞化学和高放大率的沙康蛋白α-actin进行可视化。基于模具的图案也应用于具有不同刚度的水凝胶上并排的两个心肌细胞。人类诱导多能干细胞的发现和相应的分化方案，使其成为研究肿瘤生成和发病机系的理想体外模型。

然而，使用IPS系统的一个主要限制是缺乏结构，对微环境具有特殊的生化成分和刚度与细胞相互作用。模式可以与牵引力显微镜和免疫细胞化学分析相结合，来描述心肌细胞的结构和功能。分析IPS衍生细胞类型，在我们的案例中，在更生理的形态中，为研究培养皿中具有挑战性的心肌细胞提供了机会。

该技术还可用于许多其他系统，如和高含量筛选板。形状和基板可以随应用而轻松调整。