该程序的总体目标是通过结合非规范氨基酸和点击化学，生产出同质糖基结合疫苗。遗传密码扩展是将非自然氨基酸整合到蛋白质中以改变其特性、研究或创建新蛋白质功能或获得蛋白质结合物的有力工具。一种在不同位置加入非自然氨基酸的抑制方法已成为最流行的方法。
这种方法将在这里应用于一种含有非自然氨基酸的蛋白质载体的产生，该载体含有生物角功能组。这种反应性手柄接下来可用于专门和有效地移植合成寡糖，以提供均匀糖结合疫苗。蛋白碱-莱辛，PrK，从商业Bok-lysine分两步合成。
在第一步中，Boc-lysine的未受保护的氨基酸组被转化为丙丙基氯仿酸盐。在第二步中，字母氨基酸组被除保护。合成N（阿尔法）Bo-propargyl-lysine，首先将500毫克的Bok-lysine溶解在5毫升水性一摩尔NaOH和5毫升THF的混合物中，放入烧瓶中，将烧瓶与硅隔膜混合。
在冰浴中冷却烧瓶，等待粉末溶解。然后在搅拌下两到三分钟内加入丙基氯仿酸盐滴。在室温下加热反应混合物，继续搅拌10小时。
冷却二乙醚、水性一摩尔盐酸和乙酸乙酯的溶液。冷却冰浴中的粗反应混合物。将混合物倒入分离漏斗中。
提取五十毫升二乙醚的混合物。萃取可能导致压力积聚，请确保经常释放任何压力积聚。收集水相并丢弃有机层。
在分离漏斗中的水相中小心地加入五十毫升一摩尔盐酸。然后，使用乙酸乙酯的三十毫升提取水层两次。收集有机相，通过 TLC 验证您的化合物是否存在。
在这个阶段，它应该处于有机阶段。将组合的有机层干燥在硫酸镁上。过滤掉固相。
在旋转蒸发器上在压力下将滤液集中。溶解脱盐氯仿中原油N（阿尔法）Bo-Propargyl-lysine的样品，通过NPR控制其特性。要合成丙丙基-L-莱辛，在装有隔膜的圆形纽扣瓶中引入N（阿尔法）Boc-propargyl-lysine。
在阿贡下的烧瓶中加入四毫升无水二氯甲烷。在搅拌下加入滴，四毫升三氟乙酸。更换玻璃盖的硅隔膜，以避免 TFA 损坏硅隔膜。
在室温下搅拌反应混合物一小时。验证 TLC 对 Boc-PrK 的保护。在减压下浓缩反应混合物。
在粗残留物中加入二乙醚。在褶皱玻璃上以白色固体的形式过滤蛋白丙基-L-莱辛。溶解氧化铝二甲酸二甲酸的一等素，然后进行 NMR 分析，以控制其特性和纯度。
然后，丙丙丙基-L-莱辛在蒸馏水中溶解，最终浓度为100毫升，以零下20度储存在一毫升等分中。要将质粒共同转化为表达菌株，在五分钟内在冰上解冻一百微升的化学能力E.Coli BL21。将每个质粒的一微升或每粒质粒的50至100纳米添加到细胞中，并在冰上孵育30分钟。
在45秒内在42度孵育称职细胞。然后，把它们放回冰上两分钟。加入900微升LB介质，在37度的震动下孵育一小时，以允许抗生素表达。
然后用抗生素将转化后的细菌放在LB加糖上。让细菌在37度下一夜之间生长。为了表达用PrK修饰的蛋白质，用抗生素在5毫升LB介质中接种单个共转化菌落。
在37度下孵育过夜，摇晃。第二天，用5毫升原培养基稀释含有抗生素的500毫升、0.02%的L-arabinose和1毫升的PrK，并在37度下孵育24小时。通过执行没有PrK的培养物，包括负对比，通过执行含有野生型蛋白质基因的克隆的培养，包括负对比。
在10分钟内以5000xg的离心从隔夜培养中收获细胞。丢弃上一液，将颗粒冻结在零下20度。为了通过重力流板凳亲和力色谱纯化蛋白质，将细胞颗粒重新排入二十毫升的解解缓冲液中。
加入DNase I和解酶，在30分钟内将悬浮液孵育为37度，允许解解。在五分钟内将细胞在冰中声波化，然后在30分钟内以20，000xg的离心去除细胞碎片。用0.45微米过滤器过滤酸盐，将Ni-NTA树脂加入悬浮液。
在四度下轻轻混合一小时。将悬浮液倒入聚丙烯柱中，并收集未绑定分数。用十毫升洗涤树脂，然后用五毫升的洗涤缓冲液清洗。
收集洗涤分数。用一毫米洗脱缓冲液来洗取他标记的蛋白质，重复这一步四次，并收集所有额外的分数。将含有纯组蛋白标记蛋白质的馏分混合，使用透析膜将其透析到一升TEV蛋白酶缓冲液中过夜。
将蛋白质样本收集到50毫升管中，并加入TEV缓冲液，在1毫升的最终体积中获得每毫升2毫克的最终浓度。添加一百微升的 TEV 蛋白酶。添加 50 微升 0.1 摩尔 DTT。
配有高达五毫升的 TEV 缓冲液。在四度孵育过夜，缓慢摇晃。为了去除EDTA，使用透析膜和磷酸盐缓冲液，使用5毫摩尔伊米达佐尔，在一夜之间将蛋白质解入四度。
为了消除TEV蛋白酶和未消化的蛋白质，与Ni-NTA珠子孵育混合物，并在四度下轻轻混合一小时。将悬浮液倒入聚丙烯柱中。收集了未绑定分数。
TEV蛋白酶和未消化的蛋白质与珠子保持结合，消化的蛋白质被洗出。用五毫升的洗涤缓冲液清洗柱子，并收集洗涤分数。透析消化的蛋白质对一升点击缓冲液在四度过夜与透析膜，以去除伊米达佐，以及交换缓冲液。
测量蛋白质在280纳米的浓度。为了将mPsaA与6-六氯氟辛-阿齐德或解毒剂功能化碳水化合物抗原结合，将浓度为57.8微摩尔的PrK突变蛋白放入两毫升微管中。加入10微升5毫摩尔阿齐德化合物，然后加入硫酸铜溶液和THPTA的预混合。
添加盐酸氨基瓜尼丁。加入临时准备的抗酸钠水溶液。关闭管子，通过反转几次混合，并在室温下孵育两个小时。
通过添加 EDTA 停止反应。检查 SDS 页面上的结合。迁移后，将凝胶在 312 纳米的紫外光上可视化，以表示与荧光素的结合。
或用库马西蓝染色凝胶，以可视化与碳水化合物抗原的结合。作为哈彭的添加应诱导分子量的变化。通过将糖结合应用于与PBS平衡的凝胶过滤柱中，净化糖基结合。
收集含有糖结合的馏分。对于长期储存，将糖分联对着蒸馏水进行透析，然后冷冻干燥，将糖结合物储存在零下80度。PrK 在位置 32 被引入， 以取代 Psaa N 术语附近的莱辛。
通过SDS页面和西方印迹分析，使用抗西丁标签抗体检查mPsaA生产的疗效。全长蛋白质的存在强烈地表明PrK的成功整合。然而，强度低于野生型mPsa观察到的强度。
mPsa（K32PrK）在Ni-NTA珠上被净化。以8毫克的典型产量和PrK残留物的合并最终通过质谱法确认。使用 Tev 蛋白酶在蛋白酶的蛋白酶裂解时去除的 Histidine 标签。
使用阿齐多功能化荧光素评估碱基（K32PrK）的活性，进一步用于结合合成寡糖抗原。实验与野生型mPsa相比是一种控制。最后，糖联聚酯通过凝胶过滤进行纯化，其特性通过质谱法得到确认。
在这个项目中，使用琥珀色停止胶质抑制技术准备了均质糖基结合疫苗，在定义的位点下加入一种非自然氨基酸。糖联琼疫苗同质性是保证物理化学特性完整的重要标准。因此，满足越来越多的要求苛刻的药检机构的建议。
使用经典的纯结合法不满足此标准。此外，该协议使得可以微调糖结合疫苗的结构。产生一个前所未有的工具，研究同质性与糖酸结合结构之间的关系。
