使用头太空气色谱对斑马鱼胚胎中的乙醇水平进行定量

该协议意义重大，因为它有助于了解乙醇在开发斑马鱼胚胎时的药代动力学，这将有助于在斑马鱼研究中标准化乙醇暴露制度。我们技术的主要优点是，它允许研究人员在胚胎发育期间快速、可重复地测量乙醇水平，特别是在没有血液供应的胚胎中。该方法可以方便地应用于其他模型系统以及其他环境因素，并采用适当的技术和设备设置。

我预计首次执行此协议的个人将难以在胚胎加工过程中以必要的速度防止乙醇蒸发。首先将10个胚胎与额外的胚胎液体转移到1.5毫升的微离心管中，其标记的线为250微升。向填充线添加水。

为脱光样品准备额外的微离心管。为了去除胆小菜，在100毫米培养皿中孵育胚胎，每毫升蛋白酶鸡尾酒在胚胎培养剂中孵育10分钟。每隔几分钟轻轻旋转一次盘子，以打破菜。

一旦所有的胚胎都摆脱胆小球，从蛋白酶鸡尾酒中去除它们，用新鲜介质洗两次。然后将胚胎移植到100毫米的新鲜培养皿中。当所有样品都准备好进行体积测量时，使用具有最小尖端的 P200 微移子，小心地从胚胎周围取出所有液体。

以小于 0.1 毫克的精度称水，然后通过减去 250 微升去除的水的重量来确定 10 个胚胎的体积。要确定单个胚胎的体积，请将差值除以 10。从交配罐中收集胚胎，并把它们放在一个标准的100毫米培养皿中，然后在28.5摄氏度下孵育。

受精后6小时，将多达100个胚胎移植到具有胚胎培养和1%乙醇或培养新培养皿中。盖上，但不要密封培养皿，并把它们放在28.5摄氏度的培养箱18小时或直到它们达到24小时后受精。使用两个 P200 微管设置为 50 微升，将蛋白酶鸡尾酒溶液吸进一个，然后放入第二个溶液中。

然后用玻璃移液器将10个胚胎快速放在1.5毫升的微离心管中，并关闭盖子。对所有样品进行测试、控制和乙醇处理胚胎重复此过程。一次使用一个样本，快速打开瓶盖，用 P200 微移子设置为 200 微升来吸气所有残留胚胎介质。

快速但轻轻地添加和去除50微升的水，然后添加50微升蛋白酶鸡尾酒，并关闭管盖。让样品在室温下坐10分钟，然后快速加入450微升的5摩尔氯化钠，并关闭管盖。通过涡旋10分钟使样品均质，将两个微升上流液转移到气相色谱小瓶中。

用聚四氟乙烯盖密封小瓶。完成启动方法后，加载 436 电流 SPME 乙醇两到五分钟 RG 运行。从分析软件中对样本列表中每个样本的方法菜单中的冰毒。

从空气、水和五个摩尔氯化钠蛋白酶鸡尾酒空白开始填写样品列表。然后按0.3125到40毫摩尔的顺序输入乙醇标准。遵循标准与第二轮空白。

输入所有均质胚胎上能样品，从最低到最高预测乙醇浓度进行测试，然后进入第三轮空白。将气相色谱小瓶按样品输入的顺序添加到自动取样器中，让它们加热 10 到 15 分钟。然后使用软件开始示例运行。

完成所有运行后，通过在示例列表中添加最终示例并运行备用文件来激活关闭方法。备份在示例运行期间获取的所有数据。关闭方法完成后，单击打开的色谱图并打开包含结果的文件夹。

样品会自动集成到此程序中。在结果中，确保已集成正确的峰值。确认所有样品后，打印或导出结果。

在图形上绘制乙醇标准的峰值高度，然后计算斜率、y-intercept 和 r 平方值。通过从标准的 y-intercept 中减去样品的峰值高度，并除以标准的斜率，获取每个样品的乙醇值。要计算胚胎中的乙醇浓度，计算每个样品的稀释因子，并乘以该稀释因子的样品乙醇值。

最后，通过将介质乙醇值乘以稀释因子10来计算介质参考样本。为了正确计算胚胎乙醇的浓度，测量了胚胎在胚胎中和从卵子中去除的体积。在这项分析中，胚胎占胆子内总体积的56%。

根据先前发表的作品，73.6%作为所有提出的分析的胚胎含水量。这导致水包括胚胎体积1.1微升的0.82微升。在总的体积中，49%包含在胚胎中，51%包含在外质流体中。

在气相色谱分析中，对两组15个样品及其处理介质进行了每组测量5次。第一组的介质乙醇水平为143.6毫摩尔，第二组为133.6毫摩尔。第一组和第二组胚胎的乙醇浓度平均为63.5毫摩尔和53.1毫摩尔。

计算了每个样品的胚胎乙醇浓度与乙醇介质水平的比率。第一组有44%的介质乙醇水平，而组有40%的媒体乙醇水平。未经处理的控制胚胎以零毫摩尔介质乙醇浓度测量。

尝试此过程时，要记住的最重要的事情是，正确处理胚胎进行GC分析至关重要，因为乙醇是挥发性且会迅速蒸发的。描述执行此步骤的最佳方法，但需要练习以发展适当的肌肉记忆。这一程序将有助于规范斑马鱼的乙醇处理制度，并允许今后的工作解剖乙烷致畸的遗传和细胞机制。