快速有效地监测完整斑马鱼胚胎中正常和异常胞嘧啶甲基化的时空监测

该协议提供了一种相对快速且具有成本效益的方法，以及自动采集和分析，从而产生5-甲基胞嘧啶的低灵敏度筛选，这是一种常见的表观遗传生物标志物。该技术的主要优点在于它提供了实验设计的灵活性，用户可以根据其模型和开发阶段进行优化。该技术可用于检测化学暴露如何改变发育中生物体内5-甲基胞嘧啶的相对丰度，这通常只能通过昂贵的高trpA方法（如测序）来完成。

该方法对于任何旨在利用NCG方法了解5-甲基胞嘧啶响应环境刺激的表观遗传改变的研究都是有用的。首先在收集的早晨准备新鲜的暴露溶液。将五毫升无颗粒系统水加入 60 毫米玻璃培养皿中。

然后使用10微升微毛细管玻璃移液器将10微升二甲基亚砜或化学储备溶液转移到系统水中。旋转玻璃培养皿以确保储备溶液消散。向玻璃培养皿中再加入五毫升系统水，并旋转培养皿以使暴露溶液均质化。

用玻璃盖盖住玻璃盘，以尽量减少蒸发。接下来，使用充满RO水的喷瓶将胚胎从鱼网转移到100毫米的培养皿中。在受精后 50 小时随机分选 0.75 个活胚胎并去除多余的 RO 水。

暴露持续时间结束后，从培养箱中取出胚胎。将所有活胚胎转移到1.5毫升微量离心管中。吸出残留暴露溶液而不吸出任何胚胎。

加入500微升冷藏的4%多聚甲醛，并通过倒置几次混合胚胎。让胚胎固定并在 4 摄氏度下将 4% 多聚甲醛过夜。固定胚胎后吸出4%多聚甲醛，将胚胎重新花费在1X PBS中，并通过轻轻移液混合30秒。

使用玻璃移液管，小心地将固定胚胎转移到充满RO水的玻璃培养皿中。轻轻旋转 30 秒，然后重复洗涤一次。在设置为五倍放大倍率的体视显微镜下，使用注射器针头对胚胎进行刻膜处理。

使用针尖刺穿绒毛膜，轻轻地将其从蛋黄和细胞块上剥离。胚胎脱模后，使用玻璃微毛细管移液器将多达25个完整的胚胎转移到一个免疫组织化学篮中。将IHC篮放入24孔板中。

然后从每口井中吸出水。将胚胎重悬于每孔500微升的封闭缓冲液中，用副形和铝箔包裹板以保护其免受光照。将板在 4 摄氏度下以 100 rpm 的速度在轨道振荡器上孵育四小时。

孵育后，从每个孔中吸出封闭缓冲液。用500微升一抗溶液代替。请记住用封闭缓冲液孵育一部分载体对照胚胎，以考虑背景噪音。

重新包裹板和副成型和铝箔，让板在轨道摇床上在四摄氏度下孵育过夜。第二天从每个孔中取出一抗溶液，并用1x PBST替换。在轨道摇床上用 1x PBST 洗涤每个孔三次，每次洗涤 5 分钟。

从每个孔中吸出1x PBST，并将IHC篮子放入装有RO水的玻璃培养皿中。在标准体视显微镜下，将完整的胚胎随机分类到96孔板中，确保每孔一个胚胎。然后从单个井中取出所有RO水，并加入200微升1x PBS。

在一个G.Image下用两倍物镜在透射光和FITC下离心板三分钟。选择自动对焦以确保相机的焦点位于板的底部并偏移底部厚度。选择曝光持续时间为 100 毫秒的 FITC 波长，并将自动对焦设置为具有 Z 偏移的激光。

在开始板采集之前，观察并确认正确的图像采集和几个孔。图像采集后，使用高内涵筛选系统和定制的自动图像分析程序进行数据分析。选择96孔板上的每个胚胎，以分析荧光的总面积和综合强度。

然后将数据点制成表格，并通过"测量"并选择"打开数据日志"将数据导出到电子表格，从而将数据从高内涵筛选系统中导出。将导出的电子表格上传到部署程序包，以对每个孔的数据进行排序和汇总，并按孔数进行筛选。然后使用正确的 Excel 包将汇总的数据导出到电子表格中。

在受精后6小时评估斑马鱼胚胎的5-甲基胞嘧啶特异性总面积的分布和综合强度。x轴显示DMSO作为载体或TDCIPP作为阳性对照的暴露。Y 轴表示相对荧光。

阈值与载体处理的胚胎显着不同，如胚胎内检测到的5-甲基胞嘧啶的总面积和同一区域内的积分强度所示，表明最大信噪比。保持轭和细胞团的完整性对于正确的IHC检测非常重要。这种方法相对不敏感，仅提供相对丰度的RFU数据。

如果需要量化，可以采取更有针对性的方法。