前列腺有机体培养作为工具，将基因型和突变谱转化为药理反应

该协议提供了标准和可重复的方法，以评估前列腺器官培养物中的药理反应。前列腺器官培养提供体外系统，通过允许细胞在地下室膜基质中采用三维结构，保留体内生物学和药理反应的许多方面。我们特别兴奋地使用这些方法来评估基因型如何决定前列腺的药理反应，并模拟耐药性。

这些方法可应用于使用圆顶电镀方法的有机培养系统。然而，介质中的成分，如生长因子可能因组织类型而异。视觉演示将允许更具体和详细的讨论协议步骤，以及它们与研究人员可用的许多其他已出版的器官培养系统有何不同。

有机培养通常比二维细胞培养更耗时。请务必为这些方法分配额外的时间。首先从小鼠或人体组织中隔离前列腺器官。

薄荷和酶消化组织产生一个单一的细胞悬浮液，然后通过离心在300倍g收集细胞5分钟。数个细胞，并在地下室膜基质中重新暂停。然后在预热的有机体培养板上以适当的密度将它们板到矩阵圆顶。

圆顶应该彼此相距两毫米，并且与井的一侧相距两毫米。凝固后，从井边轻轻添加介质，以避免破坏矩阵。圆顶凝固后，在圆顶顶部添加介质，以便完全覆盖它们。

将器官增长到所需的数量，用于下游应用，使用标准计数方法确定细胞数。当器官准备好使用时，用 Pten00 移液器绘制介质，然后上下移液器，以破坏地下室膜矩阵。将悬浮液转移到 15 毫升锥形管中，以 300 次 g 的离心机进行 5 分钟。

吸上一液，用五毫升PBS清洗细胞颗粒。重复离心，然后将颗粒重新在四毫升的尝试性素替代中重新下水，并允许其消化5至10分钟，同时在37摄氏度下摇晃。加入与10%FBS相等体积的有机体介质，抑制三辛的更换，并在300倍g下离心管5分钟。

吸升液，在PBS的一毫升中重新暂停细胞。然后用40微米过滤器对细胞进行应变，以确保单细胞悬浮，并使用血细胞计对细胞进行计数。使用含有10微摩尔红激酶抑制剂Y27632的有机体培养基，将细胞悬浮液稀释至每10微升100个细胞。

将1，100个细胞转移到一个新的锥形管中，并加入285微升的基底膜基质，从而产生70%的基质浓度。接下来，将细胞播种在35微升的基质圆顶中，放在预热的24个井板中，确保每个样品进行3到5个复制。翻转板，并放在细胞培养箱中，以巩固地下室矩阵。

10分钟后，从培养箱中取出盘子，加入含有罗激酶抑制剂的介质。每两天刷新一次，七天后，计算每个圆顶建立的器官数量，并计算从细胞总数中形成的器官的百分比。在隔离了前面描述的器官之后，在基质圆顶中的种子1000到10000个细胞使用器官形成效率和生长速度作为确定最终细胞数的代理。

然后在24个井板中播种35微升的基质圆顶，让圆顶凝固。加入含有罗激酶抑制剂和首选药物的介质。使用溶解药物作为控制的车辆，执行对数 10 增量，以确定半最大值抑制浓度。

每两到三天刷新一次培养素，并在第七天分析有机体，通过执行手稿中描述的细胞生存能力分析，确定药物的药理反应。要板状器官片段而不三辛化，使用 Pten00 移液器上下吸气介质和移液器，以破坏基底膜矩阵。当基质完全中断时，将悬浮液转移到 15 毫升锥形管中，并在 300 倍 g 下离心 5 分钟。

吸升液，加入五毫升PBS。洗涤后，将器官重新在PBS的一毫升中，用玻璃巴斯特移液器三联，破坏器官。量化器官片段的数量，种子五复制与100个片段，如前所述。

七天后，根据手稿指示进行细胞生存能力测定。野生型前列腺基底细胞与发光细胞相比表现出优越的器官形成。随着CRISPR-Cas9的Pten或P53的介质损失和两者进一步增加的形成能力，器官形成量小幅增加。

抗雄激素分子对生长的影响在具有不同基因型的穆林有机体中进行了测试。P53的丢失不会对抗雄激素分子产生抗雄激素的抗性，但Pten的丧失增加了抗雄激素的抗性。然而，P53 和 Pten 的双重损耗导致了完全的电阻。

安德罗根受体抑制也改变了表型。野生类型Pten删除和P53删除器官显示器官流明大小减少，而器官类型与Pten和P53的损失是表型不受影响。不出所料，当这些细胞在侧翼下皮移植时，只有双删除的Pten和P53器官生长。

两种独特的人类前列腺癌器官MSKPCA2和MSKPCA3被测试了它们对抗雄激素分子的反应。MSKPCA2器官的增殖受到强烈抑制，而MSKPCA3器官的增殖则不受影响。MSKPCA2表示高浓度的激素受体和FKBP5以及标志性的发光蛋白。

MSKPCA3还表示基底和中质标记，没有显示FKBP5的表达，表明这些器官模型为非发光和激素无关的表型。有机体需要定期通过三叶风化或用玻璃移液器三分法来保持活力。频率取决于物种起源和基因型。

任何类型的下一代测序或蛋白质组学实验都可以按照所述程序进行。这些实验将研究表型和药理反应的分子基础。这种三维器官培养技术使研究人员能够研究在体外高度受控的遗传环境中的药理反应。

这可能是一个可靠的替代冗长的体内研究。