生物修复和益生菌发育的微生物菌株的勘探，用于生物有机物的研究与保存

我们可以分离和组装益生菌，既可促进珊瑚健康，又可减轻污染的影响，并有助于珊瑚礁在不断变化的世界中的持久性。所述的隔离和筛选方法可用于选择具有关键代谢活动的微生物，如污染物的降解或珊瑚等海洋生物的其他有益特征。此方法可用于分离能够降解任何污染物的微生物。

此外，其他材料来源可用于其他环境样品，如植物、土壤、水、任何东西。学习文献，并尝试专注于应变，可以是好候选人为你的目的。如果可能，指导这些菌株的分离方法，并避免已知的病原体。

如果您打算使用细菌联合体，那么首先调查该财团的成员是否相互对抗活动也非常重要。由于珊瑚面临越来越多的灭绝风险，这种方法开始在全世界展开，需要推广和标准化这种方法。由于一些珊瑚研究人员没有传统微生物学的经验，这就是为什么他们经常就如何继续这种方法征求意见的原因。

首先，从每个目标取样点，使用带螺丝帽的无菌瓶收集500毫升的三足水。如果稍后进行样品处理，请将瓶子保持在摄氏四度。使用一对无菌钳子和钳子从水样的同一采样点切割珊瑚碎片。

使用20毫升无菌3%盐水溶液或人工海水冲洗珊瑚碎片，以去除海水中松散附着的自由活细菌。使用钳子，将每个珊瑚碎片放入一个无菌容器中，并装有含有无菌盐水溶液的螺丝帽。使用无菌钳子和钳子，在无菌培养皿中称重五克珊瑚碎片，体重秤。

将五克珊瑚样品转移到无菌砂浆中，并使用无菌害虫将其进行。使用无菌铲将碎液样品转移到含有 25 毫升 3%氯化钠无菌溶液和 10 至 15 个 2.5 毫米的玻璃珠的无菌培养瓶中。使用 20 毫升无菌盐水溶液将砂浆洗入管中，以回收最大量的麦片。

要将微生物从不同的珊瑚舱中分离出来，请将烧瓶在取样点的水温下以150倍g持续搅拌16小时。要选择细菌，首先对珊瑚样品进行长达10至9的阴性盐水溶液的连续稀释，对水样进行10至负6的连续稀释。在丢弃尖端之前，移液器上下稀释五次。

然后每个漩涡。每次在进行下一次串行稀释之前，每次对样品进行五秒钟的涡流。每次稀释的培养皿中每稀释100微升，含有3%氯化钠的糖化肉汤或培养基并进行板制。

在目标温度下孵育板一至三天，例如摄氏26度。每天检查一次盘子。使用条纹板技术选择并隔离新板上呈现不同生长形态的菌落。

根据需要重复此步骤，使纯菌落在盘子上生长。如手稿所述，将分离物存放在摄氏四度或甘油中。要执行 EE2 降解能力测试，请从新鲜板中挑选一个菌落，并在管中接种两毫升无菌 LB 介质。

万一是甘油库存，请将10微升甘油细菌库存和条纹带到LB加糖板上。在24至28摄氏度的夜间孵育，使单菌群生长。将含有 LB 介质的管子在 24 至 28 摄氏度的恒定搅拌下以 150 倍 g 为单位。

细菌生长后，在室温下以8000倍g离心细胞，在8分钟内对细胞进行造粒。丢弃上一杯。要清洗剩余的LB汤，加入两毫升盐水重新下垂细胞。

重复洗涤两次，以确保没有碳源的痕迹。在含有EE2的唯一碳源的最小布什内尔哈斯培养基中接种洗涤和再暂停的细胞。在16至72小时的孵育后，通过光学密度在600纳米和我们在LB agar介质上形成细胞的细菌生长进行评估。

为了准备含有油水可溶性馏分和油水不溶性馏分的最小介质作为唯一的碳源，在底部含有阀门的过滤瓶中加入 1-2% 原油至 500 毫升无菌蒸馏水。将烧瓶在 24 至 28 摄氏度的温度下持续搅拌，在 150 次 g 下持续搅拌 48 小时。之后，将烧瓶放在稳定的表面上，等待 10 到 20 分钟，让可溶性和不溶性分数分离。

然后打开底部滤瓶，将油水可溶性馏块转移到新的无菌烧瓶中，从而节省油水不溶性馏分。然后准备两瓶布什内尔哈斯阿加最小介质。自动保存它。

与油水可溶性馏分相结合，成为制造500毫升加糖介质的唯一碳源。对油水不溶性部分进行同样的处理，将每种介质的约 25 毫升转移到单独的培养皿上。为了分离油降解细菌，将先前稀释的样品和移液器每次稀释的100微升重新用于含有汞培养的培养皿并进行板式处理。

请记住，要保持对板的负控制。在目标温度下孵育盘子一至三天，并重复以前一样隔离程序。在该协议中，微生物从不同的水源和珊瑚核素中分离，具有具有BMC的可推型特性，能够降解不同类别的污染物。

利用从里约热内卢联邦大学环境卫生实验中心获得的污水处理厂收集的水样，分离出33种能够降解EE2的细菌菌株。此外，利用选油降解菌的技术，分离出20种能够降解油水可溶性分馏和油水不溶性分的菌株。在微生物中筛选了BMC特征，其中发现了对珊瑚病原体霍乱弧菌有很强的对抗活性的菌株、能够降解尿素的菌株、良好的代谢酶生产者以及具有潜在有益基因的微生物。

使用生物修复和BMC接种，可以预测珊瑚从石油暴露的影响。一个从珊瑚中分离出的石油生物修复者PBMC联合体在暴露在1%油中的珊瑚核素上接种。与没有接种的珊瑚健康相比，它表现出更好的保鲜光化学能力。

不要把样品留在室温下太久。否则，微生物群落可能会发生变化，与疾病相关的微生物可能会过度生长。原油是有毒的。

在使用此污染物或您决定使用的其他污染物时，请确保使用适当的个人防护设备。这项技术为珊瑚恢复和海洋生物修复领域开辟了一条创新的道路，有可能用于尽量减少全球变化造成的经济、生态和社会影响。