从新鲜冷冻的小鼠骨骼中产生高质量RNA的激光捕获微解剖协议

你有没有想过利用激光捕获微分裂的力量来分析自然环境中特定骨细胞中的基因表达？在这里，我们描述了一个协议，将使您能够从小鼠骨骼的冷冻获得足够数量的高质量RNA。这项技术是研究基因工程小鼠模型或疾病模型中特定骨细胞中基因表达变化的重要工具。

此处描述的协议侧重于小鼠骨骼，但可用于就地研究任何物种中任何硬组织的细胞中的基因表达。帮助证明这个程序，将是克里斯蒂安舒勒，一个技术人员从我的实验室。在全身麻醉下通过排泄对小鼠进行安乐死后，迅速切除整个股骨。

使用手术刀和纸巾清洁周围软组织的股骨。接下来，将最佳切削温度化合物倒入嵌入模具中，并将股骨放入嵌入模具的底部。在液氮中捕捉冻结样品。

样品完全冷冻后，用铝箔包装，然后放在干冰上转移到冰柜中。将它们存放在零下80摄氏度，直到准备进一步处理。首先，将低温恒温设置为零下19摄氏度，将块架的温度设置为零下17摄氏度。

接下来，用70%乙醇擦拭低温恒温器的内部。将硬组织、玻璃滑梯和安装工具的一次性刀片放入低温恒温器中冷却，并在截切期间将它们放在低温恒温器内。将干冰上冷冻组织块转移到低温恒温器，并允许其平衡至少 10 分钟。

然后，按嵌入模具的底部将 OCT 块从模具中推出。将足够的 OCT 介质涂抹到块架上，将块粘附到其上，并等待 OCT 介质完全冻结。在此之后，将块架放在物体支架中并拧紧到位。

调整刀片位置，以 15 微米切割增量修剪块，以去除覆盖样品的 OCT。调整低温恒温器生成八微米的截面，并切割两到三个将被丢弃的低温分段。将粘合膜放在块上，并使用安装工具将薄膜粘附在块上。

现在，以恒定的速度缓慢地进行切割，同时通过薄膜按住该部分。将样品朝上放在低温恒温器内低温杆上预冷玻璃滑梯上的薄膜，以避免样品解冻。使用胶带将薄膜固定到玻璃滑梯上，以便于染色。

在烟气罩中，准备必要的乙醇、无 RNase 水和冰上二甲苯的解决方案，如文本协议中所述。在95%乙醇中孵育部分30秒。然后，小心地将部分浸入无 RNase 水中 30 秒，以完全去除 OCT。

接下来，将50微升商业 LCM 冷冻部分污渍分配到该部分，并在室温下孵育 10 秒。将幻灯片的边缘放在吸水纸巾上，将滑轨排空。用 100%乙醇冲洗部分 30 秒，以去除多余的污渍。

将骨骼部分浸入含有100%乙醇的第二管中30秒，然后将它们转移到100%二甲苯30秒。将胶粘膜放在干玻璃滑梯上作为支撑，注意尽可能平整薄膜。在此之后，将 PET 膜框架幻灯片放在薄膜上，然后短暂地将戴手套的手指压在薄膜上，将其连接到薄膜上。

样品将夹在膜和胶粘膜之间。胶粘膜不应折叠或起皱，薄膜和膜之间不应有气泡。首先使用表面除敏剂清洁舞台端盖支架。

将幻灯片加载到滑动架中，将盖盖装入盖座。接下来，调整焦点并获取具有 1.25 倍目标的幻灯片概览。更改为 40 倍目标并调整焦点。

使用幻灯片概述，选择感兴趣的区域。然后，调整此处所示的激光参数，确保针对每个目标优化这些参数。如果激光无法切割样品，请增加激光功率。

根据形态学标准，选择胸膜或皮质骨骼中的成骨细胞、骨质细胞和骨衬细胞。为远离目标细胞的激光路径绘制一条线，以尽量减少紫外线激光的伤害。如果激光未能切割样品，请多次应用激光或检查目标是否切割不全的斑点，并使用移动和切割选项切割这些点的组织。

将每种细胞类型收集在一个单独的0.5毫升管盖中。首先，将含有β甲醇的50微升解液分配到收集管的盖子中。将样品在盖子上上下一分钟，将样品上下打上。

接下来，向下旋转裂解液，并将含有β-美甲乙醇的裂解缓冲液的00微升添加到管子中。对于每张幻灯片，准备一个标有微离心管，其中含有含有β-β甲醇的解液缓冲液的350微升。使用 LCM 后剩余的部分提取 RNA。

小心地将薄膜与膜分离，然后缓慢地将解解缓冲液%地将样品解到该部分上。然后，将酸盐样品放在干冰上，储存在零下80摄氏度。准备好继续时，在室温下解冻落酸。

在此之后，将收集管中 LCM 收获的细胞中的 lysates 转移到新的 1.5 毫升微离心管中，然后根据制造商的说明提取 RNA。在这项研究中，开发了一种LCM协议，以获得足够数量的高质量RNA，用于小鼠股骨骨细胞的基因表达分析。LCM 使用 LCM 系统执行，该系统使用重力收集样品。

使用微胶囊电泳测量分离RNA的产率和完整性。使用不同解解方案获得的RNA质量和数量的差异，可以在代表性的凝胶和电谱图中看到。当样品在盖上上下下点一分钟时，可以从一平方毫米的微分受损骨组织中分离出约8.5毫微克RNA。

RIN 值为 8.60。或者，LCM 使用 LCM 系统执行，该系统使用散焦激光脉冲，将材料弹射到悬垂胶盖中。对于新鲜冷冻的骨骼，可以从一平方毫米的微分受损骨组织中分离出大约1.6毫微克RNA。

RIN 值为 1。总之，在此过程中要记住的最重要的事情是正确应用站立协议，防止三明治复合物中部分完全干涸，使用适当的 LCM 系统，并且不超过收获细胞的时间限制。从捕获的细胞中分离出RNA后，您可以使用RNA进行表达分析，例如通过RNA寻寻。

最后，我们想提醒您，二甲苯和β-甲苯甲醇是需要用引擎盖处理的危险物质。此外，在处理液氮和低温叶片时，请采取适当的预防措施。