使用自动工作站进行质谱测量的等离子体样品制备

这种自动化工作流程提供一致的蛋白质酶消化，具有出色的可重复性和通量。这通过质谱法提高了生物标志物发现、验证和临床应用的准确性和可靠性。该技术的优点是，整个工作流程可以完成96个样品在大约5小时与内部测定和间检测CV小于20%的大多数蛋白质。

这种精确的高通量样品制备使我们能够更大规模地研究组织或生物流体的疾病蛋白质组。此外，自动化蛋白质样本制备工作流程为高含量和定量蛋白质解剖分析提供了坚实的基础。展示这个程序的将是西奈雪松高通量中心主任秦福博士和我实验室的副研究员凯西·约翰逊先生。

在开始分析之前，将5微升的汇集健康人体血浆加入96圆深井丙烯板。加载所有样本后，打开液体处理程序设备软件，并在方法选项卡下，选择主页所有轴来定向自动液体处理程序。确认所有工作站注射器不包含可见的气泡，然后打开新方法，然后单击"运行"以启动该方法。

在 输入值中输入一个值，用于自动采样器提示，在方法末尾准备自动采样器板，然后单击"确定"。在输入值中输入一个值，用于第一列提示，然后单击"确定"。在输入用于最后一列提示的值中输入 12，然后单击"确定"。如果样品板与样本量至少为 20 微升一起使用，请在 输入值中输入 true 以用于样品板提示，然后单击"确定"。按照"引导实验室软件设置"窗口中的指示操作，然后单击"继续"。将适当的试剂加载到相应的孔中，然后单击"下一步"。再次单击"下一步"以布局自动液体处理平台，如图所示，包括试剂、反应、样品和自动取样板、六孔 90 微升尖端盒、空的 90 微升尖端盒和完整的 230 微升尖端盒。

然后单击"完成"以开始方法。在离心后继续时，取回反应板，将板放入离心机。在离心结束时，将反应板返回到自动液体处理器中的位置，然后单击"继续"。

对于液相色谱和串联质谱分析，通过流量为每分钟250微升的高压流液色谱仪，在C18 2.1和100毫米3.5微米列中解析肽，并在三四极质谱仪上进行在线分析。加载后五分钟，用 5%缓冲 B 溶液平衡柱，并在 30 分钟内用 5-35% 的缓冲 B 线性梯度对肽进行解波。在洗脱结束时，用 98%缓冲 B 清洗柱 10 分钟，然后用 5% 缓冲 B 洗涤 5 分钟，然后加载下一个样品。

对于在线分流，使用两相开关阀在后柱式吸水器进入离子源之前将其转移至废物。当所有样品都洗过后，可以处理多个反应监测数据。在这个具有代表性的分析中，从尖峰β-gal和加工血浆白蛋白蛋白监测了三种β-gal肽和两种白蛋白肽。

自动样品制备工作流程的精度计算为总蛋白质组选择反应监测工作流程方差系数减去液相色谱串联质谱法方差系数的百分比。不出所料，人类血清白蛋白和β-gal蛋白均观察到良好的信号强度。为了监测液体转移步骤的精度，可对独立试剂转移步骤中的内源性人类血清白蛋白和外源β-gal蛋白进行稳定的同位素标记肽标准。

为了验证自动蛋白质组样品制备工作流程，从当天准备的21口井中计算了日内方差值系数。40 种蛋白质的日内平均方差系数范围为 4-20% 为了评估基于板的自动化工作流的边缘效应，可以从指定列和行内的特定孔计算方差系数。在这个具有代表性的实验中，所有柱和行配置的多重反应监测信号强度相似，方差系数的百分比系数在3-22%之间。最重要的步骤是根据所需的96井板图正确添加样本，根据软件的指令正确设置试剂板。

这种自动化蛋白质组样本制备方法使研究人员能够大规模收集可靠和定量的蛋白质组学数据。