使用微注射在人赫拉细胞中分体血球定位分析

在这里，我们应用荧光标记RNA的微注射来检测RNA序列，这些序列对于将短核RNA定位到称为Cajal天体的核结构中至关重要。这项技术有两个主要优点。首先，它可以应用于短期RNA，否则很难标记和跟踪。

其次，它允许快速筛选不同的序列，并测试它们在RNA定位中的作用。在微注射前一天，种子 HeLa 或其他粘附细胞在 12 毫米盖玻片上达到 50% 的汇合在微注射时。首先，将准备好的盖玻片放入培养皿的中心，添加细胞和两毫米培养介质。

第二天，将充满细胞的培养皿放在显微镜的舞台上。使用微加载器，将三微升的 SnRNA 混合物加载到针头中，然后将针头以与 Petri 盘表面 45 度的角度安装到微注射器的支架中。使用 10 倍长距离目标查找针头。

首先，在喷油器上设置粗糙的速度并降低针头，直到它接触培养介质。使用显微镜双筒望远镜，找到针接触培养基的地方的亮点。将速度更改为精细，进一步降低针头，同时观察显微镜，直到观察到针头的尖端。

在视场中间移动针头，然后切换到 40 倍远距离目标。在此之后，选择单元格并移动单元格上方的指针。设置电池接触的压力和时间。

将针头向下移动到单元格中，然后设置微操纵器的下限。设置下限是协议最重要的部分。由于盖玻片表面并不完美，并且每个单元格都不同，因此在注射过程中必须多次设置下限。

接下来，将针头移回电池上方，然后按下喷油器操纵手柄上的喷射按钮。针头将在细胞内自动移动到设定为注射RNA混合物的地方。要完成，请按下喷油器上的菜单按钮，然后从支架上取下针头。

然后断开喷油器和微操纵器，然后断开管与喷油器的连接。微注射后，将细胞返回二氧化碳培养箱，在37摄氏度下孵育一小时。接下来，在室温下用PBS冲洗细胞三次。

在 pH 6.9 的 0.1 摩尔管中用 4% 的甲醛修复细胞 20 分钟。然后用室温PBS清洗细胞三次。如果只分析snRNA定位，请在水中短暂冲洗细胞，并用DAPI安装介质。

在额外的蛋白质定位的情况下，在室温下用0.5%Triton X-100渗透细胞5分钟。用PBS冲洗细胞三次，并用文本协议中概述的适当的初级抗体和二级抗体染色。然后用 PBS 冲洗三次，在水中冲洗一次。

在此之后，使用 DAPI 将电池安装到安装介质中。准备好成像时，请使用配备浸入式目标的高端荧光显微系统获取图像。一旦识别了微射细胞，收集一叠20 Z部分，每个样本有200纳米Z步数，并经过数学去卷。

要量化荧光信号，请首先打开 ImageJ 中的显微镜图像，然后将通道拆分为窗口。通过同步窗口工具同步窗口。接下来，绘制通过线圈免疫污染识别的卡哈尔体周围感兴趣的区域。

测量线圈定义 ROI 中 snRNA 信号的强度。确定随机放置在核质中的ROI中的snRNA荧光强度。保存测量值并计算卡哈尔体和核质中的RNA信号比。

在这项研究中，荧光标记的snRNA被微表示，以监测它们在细胞内的传输。为了测试SM位点是否对Cajal身体积累很重要，缺少SM位点的SnRNA被微入细胞核。注射到细胞质作为控制，而全长snRNA被微注入，作为一个积极的控制。

孵育后，通过间接免疫荧光对微注射细胞进行固定，对Cajal身体标记线圈进行可视化。在核质和细胞质注射后，在Cajal身体中累积的全长snRNA。相比之下，缺乏SM位点的snRNA在微注射到这个隔间后仍留在细胞质中，而没有SM位点的SnRNA的核微注射表明SM结合序列对Cajal身体定位很重要，因为这种SnRNA留在细胞核中，但不会积聚在Cajal体内。

有时，只有一个细胞隔间的微注射失败，欺骗的德克斯特拉70千代吨可以在细胞核和细胞质找到。这些单元格从进一步分析中被丢弃。尽管荧光标记的 snRNA 在注射前储存在负 80 摄氏度，但RNA可能会降解。

注入细胞质的降解性SnRNA不会被运送到细胞质中，并在细胞质中保持局部化。这种snRNA应该被丢弃，新的snRNA应该合成。正确调整细胞类型的注射和补偿压力非常重要。

正如之前说的，为细胞注射设置正确的下限对于良好的微注射至关重要。请记住，RNA 分离期间使用的苯酚氯仿是危险的，微注射针是一个尖锐的物体。处理这些材料时要小心。