外细胞囊泡的储存稳定性是细胞囊泡未来治疗使用的重要参数。我们的协议提供了一个易于适用的工具，用于评估存储对囊泡的影响。我们技术的主要优点是，通过将葡萄糖酶作为外源性标记物引入，从不同母细胞中提取的细胞外囊泡很容易比较，可以比较其可耐性。
非对称流场流量分馏（AF4）是非常敏感化合物大小排除色谱纯化的温和替代品。因为化合物在通道中遇到的压力较小。由于葡萄糖酶是一种灵敏酶，因此，通过周密的规划和进行自给和背对背的纯化和分析步骤，对粘液酶的质量有好处。
根据这些细胞的标准条件培养感兴趣的细胞系后，用无血清或额外的细胞囊泡耗尽介质替换上一提液，将细胞返回到细胞培养箱中再增加24至72小时。在孵化结束时，从每个烧瓶中收集超级纳兰特，并离心样品沉淀细胞。小心地收集细胞调节介质，而不干扰颗粒。
并再次离心介质，以清除细胞碎片和大集料。然后小心地将超级纳特转移到超离心管中。如果使用固定角度转子，则标记离心机中管的方向，以便于离心后检索细胞外囊泡颗粒。
在超离心结束时，使用血清移液器小心丢弃上流液，而不会干扰细胞外囊泡颗粒。在200微升0.2微米孔隙过滤PBS到第一个超离心管的残余上清液。重新悬浮颗粒后，将产生的细胞外囊泡悬浮液转移到下一管，以便重新悬浮随后的颗粒，直到所有细胞外囊泡颗粒都重新悬浮。
将β葡萄糖糖酶加入最终重新暂停的颗粒溶液，最终浓度为每毫升1.5毫克。和皂素到最终浓度0.1毫克每毫升。然后通过涡旋混合三秒钟，将反应在室温下放置10分钟，间歇性轻柔轻拂。
一旦葡萄糖酶被封装，一定要在同一天执行所有后续纯化囊泡评估步骤，以获得无偏不倚的储存稳定性结果。将尺寸排除色谱柱与至少两列 PBS 平衡，准备在皂素孵育后立即净化颗粒。要净化，将高达400微升的细胞外囊泡悬浮液加入到柱子上。
然后收集一毫升的分馏器。为了符合细胞外囊泡与污染蛋白和自由葡萄糖酶的分离，请根据制造商的说明，通过双辛酸测定测量蛋白质浓度。使用针对相应仪器和囊泡类型的优化参数，使用纳米颗粒跟踪分析仪器测量细胞外囊泡的大小和浓度。
为了测量葡萄糖酶活性，在纯化的细胞外囊泡的125微升中加入25微升新鲜制备的荧光素二β-D-葡萄糖酰胺，并将样品添加到黑色96孔板的一个井中。在 480 纳米的激励和 516 纳米的发射下测量板读卡器上零荧光素生产的时间。用透明塑料箔紧紧盖住板，以减少蒸发。
然后在37摄氏度下孵育防光板18小时。测量板读卡器上 18 小时荧光素的产生，正如刚刚演示的。对于细胞外囊泡冻干，在纯化的囊泡中每毫升海囊糖中加入四毫克。
在零下80摄氏度下将囊泡冷冻至少一小时。要使样品冻干，请将冻干剂的货架温度设置为 15 摄氏度，将压力设置为 0.180 毫巴。在这些条件下干燥囊泡46小时。
在主干燥步骤结束时，将货架温度设置为 25 摄氏度，将压力设置为 0035 毫巴，并在这些条件下将样品干燥两小时。然后将冻干样品储存在摄氏四度。要在储存后对样品进行补水，在冻干之前添加一个与细胞外囊泡悬浮液量相等的水量。
为了评估储存后酶的活性，将AF4仪器装上新准备的0.1微米过滤PBS，用于移动相，并在泵后将0.1微米滤膜插入峰值进气过滤器，以减少来自溶剂的颗粒噪音。拆卸后，用千禧年水清洁 AF4 的小通道。水合一种新的再生纤维素膜，分子量切断30千吨，将膜放在具有光泽的一面的烦恼上。
将宽 350 微米的空间放在通道上半部分下方，然后组装通道部件。使用扭矩螺丝刀，先拧紧螺钉到五牛顿米的扭矩，然后拧紧到 7 牛顿米的扭矩。以纵横交错的图案拧紧块周围的螺钉。
将通道入口、出口和交叉流量端口连接到日食。然后从至少三个旧样品平衡膜。在检测器流量和焦点流设置为每分钟 1 毫升和注入流量为每分钟 0.2 毫升时进行分馏运行。
经过一分钟的预对焦步骤后，在对焦中注射样品 10 分钟后注入，然后注入步长，然后将交叉流量从每分钟两毫升减小到每分钟 0.1 毫升。用洗脱步骤完成分馏运行，无需交叉流 10 分钟，然后添加洗涤步骤的洗洗和注射，然后是洗脱。然后平衡下一次运行的通道，初始交叉流量为每分钟两毫升，并设置紫外线检测器为 280 纳米。
设置所有程序后，注入样品的 300 微升，并在 ASTRA 软件中记录 UV 和光散射信号。12分半钟后，开始收集一毫升分数，直到注射后27分钟。然后进行葡萄糖酶测定和纳米颗粒跟踪分析，如所证明的。
在这里，与新鲜样本相比，在不同条件下储存7天后，从人类血管内皮细胞中分离出的颗粒回收和细胞外囊泡的大小显示出来。囊泡随后受到AF4纯化，并测量了每个粒子的葡萄糖酶活性。大小排除色谱和AF4都成功地将细胞外囊泡与自由葡萄糖酶分离。
由于AF4在颗粒和自由酶之间的分离程度较高，含有囊泡的馏分污染的可能性较小。储存后AF4纯化会从样品中去除无活性酶，从而降低每个颗粒的恢复酶活性。这种效应在储存在摄氏四度后最突出，观察到2/3的减少。
省略此额外的纯化步骤可能会导致对酶稳定性的错误假设。传输电子显微镜不会显示细胞外囊泡在没有低温保护剂的情况下冻干的形状差异。然而，扫描电子显微镜成像揭示了冻干样品中存在聚合，而在储存的负80度样品中却找不到这些聚集体。
在葡萄糖酶测定之前，从囊泡中去除自由酶至关重要。因此，需要对用于囊泡纯化的技术进行彻底评估。纯化的颗粒也可以根据其表面电荷来观察，以确定储存是否改变了膜蛋白或糖的自然成分。
使用我们的技术，即使没有已知的特定标记或可用的活动检测，也可以获得关于细胞外囊泡储存稳定性的第一个指示。
