Vivo模型中的小鸡胆膜模型,用于评估头颈部癌症的围神经入侵

该协议允许肿瘤细胞和神经之间的早期相互作用的体内研究，以及癌症神经入侵的分子通路的研究。该技术的主要优点是实验时间短，有可能在同一实验中研究内膜入侵和其他癌症表型。在第一次尝试这种技术之前，我们建议练习钻孔商业非受精卵和收获后根钢，以优化您的技术为两个程序。

演示这个程序的将是我实验室的副研究员刘敏。首先，每个实验组在38摄氏度的鸡蛋加湿孵化器中孵育6个商业无病原体受精卵，施肥后第一天为54%，每小时轮换一次。第8天，用70%乙醇清洁安乐死大鼠的后皮，用剪刀切除脊柱。

分离颈椎、胸椎和腰部区域，将脊柱部分放在带 PBS 的 10 厘米培养盘中，以保持组织样本水分。使用细腻的骨剪刀，打开背部和腹腔的胸椎和颈椎骨，将脊柱分成两半，将组织部分放入一个干净的10厘米的培养皿中，并配以新鲜的PBS。使用钳子，轻轻地将脊髓从椎骨中分离出来，以可视化背根结节。

将一对细钳的尖端放在每个结节下，抓住组织，从它放置的骨腔中拉出。收获后，立即将每个结节放入DMEM培养基中，辅以2%青霉素和链霉素或五角素或五角素和10%胎儿牛血清或FBS，以帮助防止神经组织的细菌污染。当所有甘油都收获后，将组织转移到含有新鲜DMEM培养基的新培养皿中，辅以2%的Pen-Strep加10%FBS和每毫升1.2微克的红色荧光染料，在细胞培养箱中孵化一小时。

为了准备卵子的后根结节移植，在层流柜中调暗光线，用自然产生的空气囊将卵子抱向光源，将每个卵子转光，以检查小鸡的生存能力和胚胎期。将发育中的胚胎附着在卵膜上，作为附着在蛋膜上的暗移动容器，并使用铅笔标记附着，以避免在此区域进行干预。在距离胚胎附件至少两厘米的血管化区域中绘制 1.5 厘米的区域，作为操作窗口区域，并在距离操作窗口约 1 厘米的血管化区域中绘制 0.5 厘米的平方。

然后标记气囊区域的中心。接下来，使用旋转工具和雕刻钻，直径为三毫米的钻头，在标记的方块内小心钻蛋壳。使用钝钳去除蛋壳，而不取下壳下的白色外蛋壳膜。

使用钻头在气囊区域的标记十字架上小心地进行精确钻孔穿孔，使气流进入蛋壳，而不会损坏或损坏壳体，并在完好的蛋壳膜上的方形开口中加入 30 微升 HBSS。使用 30 量针，在方形区域内的外膜中精确穿孔。接下来，将鸡蛋放在光源上以可视化气囊，并给滴管橡胶灯泡施加压力。

将滴管灯泡放在气囊内的小穿孔上，释放灯泡上的压力，直到观察到操作窗口范围内的外膜和巧克力膜分离，重复此步骤，直到实现膜的完全分离。当所有鸡蛋都经过相同方式的修改时，在一个鸡蛋中钻出圆形操作窗口，注意不要破裂外蛋壳膜，并使用一块胶带的粘性面去除壳体中任何松动的颗粒。使用钝钳，从钻孔区域取出蛋壳，然后从外蛋壳膜上取出蛋壳，注意不要将小壳颗粒引入蛋内，以尽量减少污染。

当蛋壳和外膜被移除时，用石蜡膜盖住鸡蛋，将卵子放回蛋箱，无需旋转，直到背根结石准备好嫁接。要将背根结节移植到胆汁膜上，使用细的无菌钳子小心地抓住培养皿中的一根结节，并在新鲜 HBSS 容器中轻轻清洗组织。将结节放在一个鸡蛋的胆结膜上，小心不要刺穿膜，用无菌的透明薄膜敷料覆盖所有蛋口。

当所有卵子被嫁接后，将它们返回到加湿的卵子孵化器，无需旋转两天。在孵化结束时，将卵子转移到层流柜，并使用剪刀和钳子打开透明薄膜敷料。接下来，在五微升的HS中加入0.5到100万个荧光标记的肿瘤细胞，加入每个卵子的胆管膜，每个背根结节约两毫米，保持结节和细胞之间的均匀距离。

然后用新的薄膜敷料盖住鸡蛋，将鸡蛋返回卵子孵化器七天，无需旋转。在孵育结束时，将卵子放在实验室的长椅上。使用注射器打孔每个鸡蛋的薄膜敷料，并在每个巧克力膜上涂抹约300微升4%的甲醛，使组织稍微僵硬，以方便收获过程。

用剪刀，取出蛋壳的上半部分，并附上巧克力膜。将壳体的大小减小到直径约三厘米，保持胆结膜部分，在壳体片段中心内移植了后根结节和肿瘤细胞。然后用细钳抓住胆结膜，将组织从蛋壳中分离出来，转移到一个六孔板的一个井中，其中含有两毫升4%的准甲醛，每个井背根结节和肿瘤细胞侧向上。

将后根结节整合到胆管膜中非常重要，因为胆根结节膜在实验中为后根结节组织提供营养。微观上，在胆管膜的结缔组织内观察到后根结节，血管经常在后根结节组织内看到，表明胆根结节血供应正在培育移植的组织。植入的肿瘤也通过赤氧林和 eosin 染色在胆碱膜上识别。

根据存在多少入侵，肿瘤可能存在，没有到许多肿瘤岛入侵结缔组织。在这个具有代表性的实验中，与合并荧光分析的成像显示，与控制肿瘤相比，与控制肿瘤相比，与肿瘤细胞结合的胆结膜中，胆结根的侵入侵增加。这种有用且具有成本效益的内膜入侵模型，即使资源有限的实验室也可以复制。