应用先进的体外培养技术研究人肠道微生物群

该协议的目标是在体外培养肠道微生物群。它将允许研究微生物群动力学，而不必考虑现代成分的贡献。利用这个多阶段体外系统，我们计算微生物群落在发光和多区域的结肠可以同时启动的微生物群落。

由于体外系统的复杂性，此方法的视觉演示非常有用。首先用500毫升的已定义介质填充上升冒号，用800毫升的已定义介质填充横向冒号，用600毫升的已定义介质填充下降冒号。将粘液加在结肠区域，其量与反应器的体积成正比，并使用样品管和注射器从每个反应器中去除任何多余的定介质。

使用 pH 探头调整每个反应器中的 pH。打开氮气冲洗20分钟。接下来，在用粪便均质样品装入60毫升注射器之前，根据制造商的指南解冻粪便均质。

然后，通过样品端口为每个结肠反应器接种相当于每个反应器体积的5%的均质量，用于隔夜培养pH值控制。第二天早上，用酒精清洁每个生物反应器样品口的卢尔锁。当端口干燥后，将 30 毫升注射器（清除所有空气）连接到其中一个样品端口。

在从生物反应器中吸入15毫升的培养物超生体之前，将柱塞提取三到五次，以确保容器成分的彻底混合。然后将发光样品转移到无菌的猎鹰管中，放在冰上。对于DNA分析，使用五毫升注射器收集一到三毫升的发光液。

以相同的方式收集其他生物反应器的超生形式。为了留出样品材料进行短链脂肪酸分析，将15毫升的发光样品用于进行分离，通过0.2微米孔隙过滤器将超盐过滤，用于零下80摄氏度的储存。为了留出样品材料进行DNA分析，将一毫升发光液离心机，将颗粒储存在零下80摄氏度。

对于粘膜样品的收获，从四摄氏度的储存中去除准备好的粘液载体，然后打开氮气冲洗。快速打开反应器盖，用新反应堆更换每个反应堆中 50% 的车厢。更换所有托架后，快速重新密封盖子，将氮气冲洗再保持 20 分钟。

然后等分0.25至0.5克粘液载体的阿加到个别两毫升管中，储存零下80摄氏度直到DNA提取。系统每天三次自动循环。这从140毫升的确定介质转移到胃生物反应器，然后一个小时的孵育与pH控制开始。

在孵育结束时，胃中的内容与60毫升胰腺汁一起被转移到小肠中。在小肠生物反应器中，pH值自动调整为6.7至6.9，内容物孵育90分钟。在此孵育期间，每个系统的氮冲洗将打开共10分钟。

在此孵育结束时，从小肠中的内容被转移到上升结肠中，从上升结肠转移到横向结肠，从横向结肠转移到下降结肠，从下降结肠转移到废物。在这个代表性的主要坐标分析中，社区在第一天和第七天之间发生了贬值变化。然而，从接种后第11天到实验结束，样本占据了一小块区域的主要坐标分析空间，为两个样本样本提供基于操作分类单位、存在到不存在和丰度的样本距离分数。

对三种突出的短链脂肪酸的测量表明，丙酸、巴诺酸和醋酸从实验开始一直到接种后第15天波动。第15天之后，每个结肠区域产生的这些酸的含量保持不变，在实验结束之前变化很小。对每个结肠区域的发光和粘膜相的稳定群落的分析表明，在体外系统各个结肠区域发育的群落与粪便的内分组成相似。

对体外系统的α多样性的比较揭示了与除上升区域的发光样本以外的所有区域的入体多样性水平。证明体外培养系统能够在组成和多样性方面产生可与粪便的致病社区。要使用此协议产生稳定的肠道微生物群落，必须确保准确准备溶液，并确保在整个实验中保持厌氧条件和pH参数。

按照此过程，可以使用下一代DNA测序分析社区成分样本，然后进行生物信息分析，并使用代谢组学分析功能。