利用微阵列研究微环境对癌症细胞表型的影响

由于肿瘤微环境的复杂性，研究肿瘤微环境是困难的。我们开发了由简单的组合微环境组成的微环境，允许识别肿瘤细胞表型的主要驱动因素。MEMA 平台的主要优点是，由于微环境条件都定义了，因此很容易识别驱动感兴趣表型的微环境因素。

MEMA平台广泛适用于其他非癌症系统，包括原细胞株和干细胞。我们开发了许多工程技巧和步骤来加快湿式工作并简化协议。首先，使用触摸销打印机将基准点中的细胞外矩阵打印混合物打印到八孔板中。

使用以四倍七打印头配置排列的直径为 350 微米的引脚打印微环境微阵列的细胞外矩阵。胶原蛋白块作为网格打印到 MEMAs 上。PBS 填充井提供额外的湿度，以防止从细胞外基质打印混合物源板中干燥。

将八孔板中的阵列打印为 20 列，35 行，共 700 个点。打印后，在干燥器中存放印版至少三天，然后使用。首先，设计一个96孔板布局与间距，允许使用多通道移液器与四个间隔尖端，使许多 MEMA 板的治疗可以一次完成。

然后从冰柜中取出配体，在层流罩中的冰中解冻。简要轻拂并旋转每个管。使用制造商推荐的缓冲液将配体稀释为 200 倍的工作库存。

移液 10 微升每个 200 倍配体股票到相应的井内 96 井板。使用密封膜密封板，并将其存放在零下20摄氏度。成批制作配体处理板，并捕获所有元数据以进行下游分析。

在培养细胞之前，用每井两毫升的非污污阻塞缓冲液阻断缓冲液阻断 MEMAs 20 分钟。使用带两个巴斯德移液器的 Y 分路器，在多个孔中同时吸气阻塞缓冲液，然后用 PBS 三重清洗孔。为防止干燥，请将 PBS 的最终体积留在井中，直到准备好进行细胞电镀。

在进行完整的 MEMA 实验之前，通过执行细胞滴定实验优化 MCF7 细胞种子浓度。理想的点（如图所示）具有足够的单元格数来提取数据，但数量并不多，以致该点过于汇合。在 MEMA 中，将剩余的 PBS 和种子 MCF7 细胞吸进 30，000 至 35，000 个细胞，每井以两毫升种子介质进行吸气。

将 MEMA 放在 37 摄氏度的孵化器中。在培养箱中隔夜粘附后，吸气培养的培养物，代之以两毫升的生长介质，以分离特定配体对刺激作用。然后在冰上解冻以前冻结的配体处理板。

将离心板以200倍g下解冻一分钟。将 MEMA 培养板中每一井的 200 微升介质转移到配体处理板中合适的井中。上下移液，将配体与介质混合，将混合物移回 MEMA 培养板中的适当井。

用手轻轻摇动，将 MEMA 板返回到孵化器，在 37 摄氏度和 5% 的二氧化碳下培养配体-ECM 组合。71 小时后，在 MEMA 油井中加入 100 次 EdU，最终浓度为 10 微摩尔。在37摄氏度和5%的二氧化碳下再孵育一小时。

最后孵育后，吸气井。在室温下，将 MEMAs 固定为每井 2%PFA 的两毫升，15 分钟。然后从井中吸入 PFA。

每井用两毫升0.1%非日性表面活性剂进行渗透，15分钟。吸气表面活性剂，然后用两毫升的PBS和PBS-T，按顺序清洗水井。之后，向每一井加入1.5毫升EdU检测反应试剂。

在室温下孵育一小时，摇动并保护免受光线影响。然后用每孔1.5毫升商用淬火缓冲液淬火反应。再次吸气，用PBS-T清洗，然后用优化浓度的污渍或抗体进行孵化。

在染色缓冲液中用原抗体孵育 MEMA 井，在四摄氏度下一夜之间摇动。在初级抗体孵育后，用PBS洗井，然后用PBS-T洗井。每毫升DAPI加入0.5微克的二次抗体，在染色缓冲液中稀释。

孵育，在黑暗中室温下摇摆一小时。每孔 PBS 用两毫升清洗井两次，并将它们留在 PBS 的最后两毫升中。要成像染色的 MEMA，请将它放在具有适当荧光检测通道的自动成像系统的显微镜舞台上。

将生成的图像数据输出到图像管理系统。使用 CellProfiler 对单元格进行分段并计算强度水平。在此协议中，装箱 DAPI 强度值的细胞周期配置文件与来自一个八井板的细胞计数指示 G1 与 G2 细胞周期相中的细胞。

这对应于细胞在早期生长阶段的两个nDNA含量，以及即将经历分切的细胞中的四个nDNA含量。显示了配体和 ECM 的微环境对单元号和 EdU 合并的影响。红色表示单元格数较高，蓝色表示较低的单元格数。

许多影响是配体驱动的，因为 ECM 条件没有强烈影响细胞号或 EdU 的积极性。Natagen 1 是一个明显的例外，因为此 ECM 分子的存在会抑制 MCF7 的细胞结合和生长。配体，如FGF6和neuregulin-1α增强细胞数，具有高率的EdU合并率，而配体，如安菲鲁林和内鲁古林-1SMDF抑制细胞结合和细胞生长。

用神经古林-1α治疗的 MEMA 点生长的 MCF7 细胞的例子显示，EdU 合并率很高，以粉红色核表示。在此图像中，绿色污渍是细胞掩码，蓝色是 DAPI。由于完整的 MEMA 实验成本高昂，因此在执行完整实验之前执行优化步骤（如细胞和血清滴定）非常重要。

使用 MEMA 平台确定感兴趣的微环境条件后，可以使用传统的 2D 和 3D 细胞培养系统更深入地研究特定的配体和细胞外基质蛋白。