该协议演示了一种简单和可产生的方法，使用EGFP表达大肠杆菌评估巨噬细胞的噬菌体细胞形成能力。你好，我叫大连医科大学第二医院的俊宇。今天，我们将向您展示一个简单和可视化的方式来评估巨噬细胞病，可以很容易地在两个小时内完成。
该方法在先天免疫功能的研究中得到了广泛的应用。据认为，老年人的先天免疫功能仍然完好无损。因此，今天我们将从老年和年轻的小鼠中分离出内酮巨噬细胞，并了解这两组小鼠的吞噬能力。
好吧，我们开始吧。首先，合成EGFP基因片段，使用高保真TaqDNA聚合酶克隆片段。然后将 PCR 产品放入 pET SUMO 矢量中。
第三，将结扎产品转化为大肠杆菌菌株，诱导用乳糖表达EGFP。这些EGFP表达大肠杆菌作为噬菌体测定的标记。接下来，对小鼠食距巨噬细胞进行分离和培养。
然后，EGFP表达大肠杆菌与巨噬细胞在37摄氏度下被铸造一小时。淬火步骤后，宏噬细胞已做好荧光显微镜和流式细胞仪的测评准备。合成EGFP基因片段，并使用高保真TaqDNA聚合酶用正向和反向底转放大片段。
为确保 PCR 产品在下一步中具有用于 TA 克隆的单三端腺苷悬垂，建议在上一个周期后以 72 摄氏度的 30 分钟扩展。通过阿加罗斯凝胶电泳检查 PCR 产品。如果片段被正确放大，可以在凝胶上观察到717 bp波段。
使用使用 T4 DNA 连接酶的 TA 克隆方法将 PCR 产品克隆到 pET SUMO 载体中。在室温下孵育反应30分钟。将五微升PCR产品加入100微升的BL21功能细胞中。
热在42摄氏度下冲击细胞90秒，然后将混合物留在冰上3分钟。加入 400 微升 LB 介质，在 37 摄氏度下预热。在 37 摄氏度和 120 rpm 转速下摇动一小时。
将细菌接种到LB板表面，每毫升卡那霉素100微克，以筛查病媒转化的大肠杆菌。在37摄氏度的烤箱中孵育一夜。第二天，用每毫升卡纳霉素100微克接种5毫升LB介质的阳性菌落。
在 37 摄氏度的振动培养箱中孵育，在 120 rpm 时孵育两个小时。然后将诱导乳糖加入每升0.5毫摩尔的最终浓度，并继续摇晃6小时，诱导EGFP表达。经验上，当震动6小时时，OD600可能达到0.7或更高。
最后，利用荧光显微镜验证EGFP表达的程度。在幻灯片中加入 10 微升的细菌培养介质。然后用盖板盖住。
检查荧光显微镜下EGFP的表达。在100毫升蒸馏水中加入3.5克硫化醇。使用前在自用器中消毒。
将硫化醇介质吸入发动机罩中一毫升无菌注射器。每个注射器一只鼠标，以避免感染。用23测针将一毫升3.5%硫化基注射到小鼠腹腔中，用水和食物维持小鼠三天。
三天后，在闭合的盒子里迅速诱导麻醉后，通过宫颈脱位使小鼠安乐死。然后，将鼠标放入75%乙醇的盘中进行无菌，并迅速转移到机罩中。将鼠标放在板上，将前爪固定在板上以固定鼠标位置。
使用5毫升注射器与20规格的针头，注射5毫升的冷PBS在下腹部到小鼠腹膜腔，避免刺穿肠道。在小鼠腹部的两侧进行温和的按摩。然后轻轻地慢慢吸气腹部液体。
将内酮液分配到 50 毫升离心管中。重复这些步骤两到三次。在4至8摄氏度内将悬浮细胞在400克下离心10分钟。
丢弃上一提液，用10%的胎儿牛血清在RPMI 1640培养基中重新暂停细胞颗粒。将500万个细胞加入六井板的每个井中，用于流动细胞测定，每井50万个细胞加入荧光显微镜的24井板中。在5%的二氧化碳培养箱中培养37摄氏度的细胞。
培养基可以在三个小时后刷新，以去除非连续细胞，因为大多数是淋巴细胞。在明亮的场显微镜下观察细胞，以评估细胞的生存能力和细胞密度。此处显示的图像处于主单元格的正常状态。
通常，巨噬细胞密度不高，因为内膜细胞的主要部分是淋巴细胞。从 24 井板中去除培养介质。加入100微升新鲜培养剂和10微升细菌培养。
然后在5%的二氧化碳培养箱中孵育37摄氏度的板，孵育一小时。每井用 500 微升的冷 PBS 轻轻清洗三到五次，以洗净非内化细菌。在室温下用PBS中4%甲醛孵育细胞30分钟。
用PBS清洗细胞三次。添加法罗丁633结合工作溶液，以染色F-actin。在室温下存放在黑暗潮湿的地方60分钟。
加入DAPI工作溶液，在室温的黑暗地方染色细胞核并孵育5分钟。用 PBS 冲洗一次，在蒸馏水中用相同体积冲洗一次。以绿色显示的EGFP表达大肠杆菌是噬菌体病的标记。
为了尽量减少实验误差，并正确解释结果，请为实验设置组和控制管，如表2所列。对于将放在冰上的控制组，从六井板中取下介质，用 PBS 清洗一次。然后将每升70毫升冷EDTA加入井中，分离细胞并转移到流动的细胞仪管中。
将50微升的细菌悬浮液加入管子，放在冰上一小时。对于其他组，删除培养介质，在每个井中添加一毫升新鲜介质。根据表二中描述的组设置，在井中加入50微升的细菌悬浮液。
然后将六井板放在37度5%的二氧化碳培养箱中一小时。为了淬火非内化大肠杆菌的荧光，在井中加入200微升0.8%的水晶紫水溶液，并很快摇摆。此步骤旨在避免 EGFP 大肠杆菌与巨噬细胞表面结合，但非内化导致误报结果。
用PBS清洗细胞三次，去除任何残留的水晶紫罗兰。然后将每升70毫升冷EDTA加入井中，分离细胞并转移到流动的细胞仪管中。离心管2000转/5分钟，并丢弃上流水。
添加 100 微升 PBS 以重新暂停细胞。根据组设置，将五微升的 F4 ATP 结合抗体加入管中或等值。漩涡在黑暗中短暂地孵育样品5至10分钟。
在每个管中加入一毫升 PBS，5 分钟离心 2，000 rpm。丢弃上一杯。用 200 到 300 微升 PBS 重新泵化细胞颗粒，用于流式细胞测量分析。
运行每个管并获取至少 10，000 个 F4/80 阳性细胞事件的数据。以下是来自年轻和老年群体的围食巨噬细胞的荧光图像。红色荧光表示F-actin。
绿色表示EGFP表达大肠杆菌，蓝色代表被DAPI染色的原子核。这些图像表明，来自年轻小鼠的巨噬细胞比老年小鼠的巨噬细胞具有更强的噬菌体能力。F4/80阳性和EGFP阳性细胞表明巨噬细胞的噬菌体能力。
这些结果与荧光显微镜结果的趋势一致。嗯，你看，虽然先天免疫细胞的数量可以保留在老小鼠，噬菌体能力明显下降相比，年轻的小鼠。许多方法已被用于评估巨噬细胞噬菌体。
在这里，我们演示了一种方便、快捷、经济可行的改进方法。使用EGFP表达大肠杆菌，噬菌体测定可以方便地通过流动细胞仪和荧光显微镜根据研究人员的喜欢进行和测量。此外，该方法直接测量噬菌细胞的能力。
结果与其他间接方法相比更具可重复性。
