手动棋盘阵列协同测试是一种劳动密集型且容易出错的方法。相比之下，我们的自动喷墨打印机棋盘方法显著提高了速度、准确性和吞吐量。自动棋盘方法可以筛选大量药物的协同组合，而时间杀法可以确认和进一步探索这些组合的活动。
新型抗生素的发现跟不上耐药性的传播，但对协同组合的调查为抢救现有药物以治疗耐药细菌提供了可能。虽然我们演示了这种技术与抗菌，它也可以用于其他类别的抗菌药物，甚至不同类型的组合药物或化合物测试。在此视频中，我们将演示自动棋盘阵列方法和手动时间终止方法。
我们建议首先执行棋盘阵列研究，以确定有希望的组合，然后通过时间终止研究进一步研究这些组合。首先，制作科利巴汀和米诺环素的抗菌库存解决方案，然后对所附文本协议中描述的库存溶液进行质量控制。接下来，在12毫米/75毫米圆形底部玻璃培养管中加入约1毫升0.9%氯化钠，盐水。
从一盘通宵细菌中选择一个或两个菌落，并把它们放入培养管中。轻轻旋转管子，将溶液中的细菌悬浮。使用麦克法兰读卡器检查细菌的浓度。
通过添加更多盐水或更多细菌来调节浓度，实现 0.5 麦克法兰浊度读数。然后，将悬浮液的100微升加入30毫升的阳离子调节穆勒-欣顿汤，在50毫升的圆锥管中稀释细菌1至300，以达到最终细胞密度的5倍10到每毫升第五组形成单位。现在，在随附的文本协议中按照以下步骤准备用于打印的抗菌剂。
保存协议，然后单击左上角的"运行"按钮，后跟"开始"按钮。将 384 井板加载到板架上，然后按"加载板 1 协同"提示下加载。然后，将 T8+盒放入盒式插槽中，然后按"加载 T8+盒"提示符下加载。
当提示时，在盒式磁带上指示的储液罐中添加抗生素库存溶液。添加每个解决方案后，按"填充"按钮。一旦 D300 分配器向每个井中按适当的体积添加抗生素库存，并且出现"运行完成"框，单击"关闭"，取出板，然后关闭 D300。
接下来，将先前准备的细菌悬浮液倒入无菌试剂库中。使用多通道移液器将悬架的 50 微升添加到棋盘阵列中的所有孔中。然后，在空井中加入50微升的阳离子调节穆勒-欣顿汤，没有细菌。
这将是负控制井，以确认媒体的无菌性。在35摄氏度的环境空气培养箱中孵育16至20小时。要分析测试，请按照随附的文本协议进行。
对于时间杀效测试，请再次准备文本协议中描述的抗菌库存解决方案。然后，在无菌盐水中对测试生物体进行0.5麦克法兰悬浮。在 25 x 150 毫米玻璃圆形底部培养管中加入 100 微升 0.5 McFarland 悬浮液，轻轻混合。
使用无菌接种回路，隔离条纹稀释悬浮液滴到血脂板上，并在环境空气中在35摄氏度下孵育该板，以确认接种纯度。更换管上的闭合，并在环境空气中 35 摄氏度的摇床试管架上孵育至少 3 小时，直到达到对数相生长。当最初的培养是孵化时，在五个自动 <3> <3>开的玻璃培养管中加入10毫升的阳离子调节穆勒-欣顿汤。
对于时间杀效的协同研究，至少一种药物的浓度不应单独影响生长曲线。这可以通过在协同研究之前评估单个药物浓度的影响来确定。在第一管，加入10微升每毫升一毫克的科利丁糖，以获得每毫升1微克的最终共利明浓度，因为这种浓度对本例中使用的菌株无效。
对于第二管，加入10微升每毫升1毫克的米诺环素，以获得每毫升1微克的最终浓度。这种浓度对本示例中使用的菌株也无效。在第三管上，加入10微升每毫升一毫克的米诺环素库存和10微升每毫升科利丁素库存1毫克。
这是相同数量的科利丁和米诺环素用于管一和二。在第四和第五管中，不添加抗生素。这将是分别增长控制和负控制管。
接下来，准备96个深井聚丙烯板与两毫升井进行连续稀释，通过多通道移液器将900微升无菌盐水加入B行至H列的B至H列。当培养处于对数生长阶段时，从摇床中去除培养管，轻轻旋转。将悬浮液的一毫升转移到 12 到 75 毫米的玻璃培养管中，然后使用麦克法兰读卡器检查密度。
如果密度小于 1.0 麦克法兰，将管返回摇床并孵育更长时间。如果它大于 1.0 麦克法兰，添加阳离子调整穆勒-欣顿汤到管，轻轻涡流，并重新采样，直到悬浮液在1.0麦克法兰。在准备开始的内分时，文化处于对数生长阶段，这一点很重要。
您可以构建一个生长曲线来确定生物体何时到达此阶段。然后，将 1.0 McFarland 悬浮液的 100 微升添加到管一到四管中，然后轻轻旋转。混合后，在一、二、四、六和二十四小时内，通过倾斜管，立即从每个培养管中去除 150 微升的等分，使只有无菌移液器尖端进入管内，而不是在等分提取过程中进入非无菌移液器轴。
分别向先前准备的96个深井板第一排的连续油井添加等分。在每个时间点去除等件后，立即将管在 35 摄氏度的环境空气培养箱中将管式回放在摇床上的试管架上。使用多通道移液器，从板的 A 行中去除 100 微升，并将其添加到包含 900 微升盐水的 B 行中，从而产生 1 到 10 的稀释。
上下四到五次将溶液移位混合，然后丢弃提示。首先，标记穆勒-欣顿阿加板与抗生素条件和稀释要镀。然后，使用滴板方法，使用带超长尖端的多通道移液器，将稀释的样品进行片点计数。
从第一列的每一个井中拆下 10 微升，然后小心地将一排点放在贴有适当标签的板上。继续，直到所有行都分配到板上。此外，在24小时时间点，将直接从负控制管处取出的10微升跌落到专用点，以测试不育性。
然后，反转所有板，并在35摄氏度的环境空气中孵育过夜。然后，计算每个区域的菌落数，并计算细胞密度。在板的对面上用细尖永久标记标记菌落，以避免重复计数或丢失的菌落。
对于每个稀释系列，识别有3到30个菌落的滴。计算这些下降中的菌落，并记录计数以及稀释因子。这里展示的是棋盘阵列协同实验的网格，其中每毫升浓度为0至32微克的米诺环素与每毫升0至16微克浓度的科利丁结合，并针对大肠杆菌菌株进行测试。
OD600 值低于 07 的井表示无生长，阴影为红色，而 OD600 值高于或等于 07 的井表示生长，阴影为绿色。对于每种药物，最低抑制浓度是抑制细菌生长的最低浓度药物。对于米诺环素，这是32微克每毫升，而对于科利丁，它是8微克每毫升。
底纹保留于此处，但抑制生长的井内的值被分数抑制浓度（FIC）的索引值所取代。在每一个井中，通过将该井中抗生素的浓度除以该井的最低抑制浓度来计算每个药物的FIP指数。FIC 指数小于或等于 0.5 的井（被视为协同效应的截止点）表示具有断线边界，而最低 FIC 指数的井则粗体。
由于最小 FIC 值在协同范围内，因此组合被视为协同。此处显示了一个不显示协同作用的案例示例，因为抑制增长的最低 FIC 指数是 1，大于 0.5。最后，在此示例中，发生了几个跳过的井，这表示细菌生长被抑制，尽管存在细菌生长在相邻的井与高浓度的抗生素。
如果在棋盘数组中发生了多个跳过良好情况，则应丢弃结果并重复检测。此处介绍了一个显示时间-杀死协同分析结果的图形示例。有关时间终止协同分析解释的详细信息，请参阅随附的文本协议。
有关协同组合活性的进一步信息可以通过药代动力学和药理学的评价以及通过动物模型的体内研究获得。使用细菌时，始终遵循适当的安全程序，包括使用个人防护设备。如果您产生气溶胶或使用高风险病原体，请执行生物安全柜中的所有工作。
