常规 rt-pcr 和 sybr 绿色 rt-qpcr 检测罗非鱼

欢迎大家我叫温·苏拉切蓬。我是泰国卡塞特斯塔特大学兽医微生物学和免疫学系助理教授。

我和我的团队专门从事罗非鱼中新出现的病毒性疾病。我们现在正在研究罗非鱼湖病毒，这种病毒导致罗非鱼的高死亡率。由于罗非鱼是全世界第二大养殖鱼类，它为一百万人提供蛋白质来源，对粮食安全起着重要作用。

因此，最近暴发的罗非鱼湖病毒引起了社会经济的影响，导致许多科学家试图找到解决这个问题的方法。到目前为止，我们需要一个非常敏感，快速和准确的方法来检测病毒。在此视频中，我们将向您展示从样本采集、样本群和实时 PCR 分析开始检测鱼组织中的罗非鱼湖病毒。

首先，将水中过量的布油溶解，使鱼安乐死。将死鱼放在托盘上，使用 95% 乙醇对设备进行消毒，然后用酒精燃烧器燃烧。慢慢切开鱼从下腹部向上，收集肝脏。

将肝脏的一部分收集到1.5毫升的离心管中。RNA提取的第一部分应在拉米纳尔流罩中进行，并穿戴防护设备。将一毫升RNA提取试剂加入管中。

使用组织害虫将肝脏粉化成均匀。在管中加入200微升氯仿。然后，通过反转管几次轻轻混合。

在室温下留出三分钟。在12，000 RCF的4摄氏度下离心15分钟。小心地从离心机中收集管子。

轻轻将无色上水相的 500 微升转移到新管中。向管中加入一卷异丙醇。在零下20摄氏度下加热两个小时或长达一夜，以沉淀RNA。

孵育后，在相同的离心机条件下将溶液离心。从离心机收集管子，然后丢弃上流液。RNA 颗粒可被箭头视为指向。

将一毫升75%乙醇加入管中清洗RNA颗粒，并反转数次。在摄氏4度，在10，000 RCF下离心15分钟。从离心机收集管子，然后丢弃上流液。

使用自动移液器抽出剩余的乙醇，在室温下空气干燥5至10分钟。加入30至60微升RNase自由水，预热至55至60摄氏度，使RNA颗粒溶解。使用一至两微升RNA溶液使用微体积分光光度计测量浓度。

结果将显示在屏幕上。使用无 RNase 水将浓度稀释到每微升 200 纳克。使用以下列出的化学品和条件进行 cDNA 合成。

使用热循环器将RNA转化为cDNA，并符合建议的条件。以下是使用实时 PCR 确定 TiLV 负载的化学品和条件。将 qPCR 主混合物分配到每瓶白色 qPCR 条管中，将六毫升混合。

随后，将四毫升的cDNA样品加载到井中。在此阶段，必须在每一个井中更换新的管尖，以避免样品受到污染。用透明 qPCR 条盖紧密密封 qPCR 条带。

通过轻拂条带的尖端，轻轻混合溶液。然后使用微型离心机向下旋转，收集容器底部的所有液体。使用视频中显示的两步条件，在 96 井板中选择要使用的井。

选择网络绿色作为染料的植物。选择未知作为示例类型，并将名称插入示例名称框中。打开实时 PCR 机器的盖子，将 qPCR 条带放入分配的井中。

然后合上盖子。使用所选条件运行机器。盖达到所需温度后，机器将启动并运行。

qPCR 条件结束后，显示放大曲线。此处，速率箭头指出阈值水平在指数相位和线性相位之间被切断，从而产生 CT 值。然后将 CT 值外推到病毒日志副本编号中，以计算使用标准曲线保留的病毒数量。

融化峰值还显示，以确定 qPCR 检测到的病毒是否是 TiLV，其中熔融峰值一般在 79.5 至 80.5 摄氏度之间。因此，我们希望这种方法将成为世界各地的农民和组织的重要工具，他们可能需要实施控制并限制TiLV感染的传播。