体内高分子量截离法从脑间质液中提取大细胞外蛋白的微透析方法

这种方法可以帮助回答神经科学研究领域关于信号转导基板传输和废物清除如何在脑外空间发生关键问题。该技术的主要优点是，它允许对唤醒自由移动的动物的间质流体或 ISF 中的大细胞外分子进行采样和定量。在确认对手趾捏没有反应后，从麻醉小鼠的头骨上取下头发，并使用耳条和鼻夹将固定动物固定在适配器上。

将软膏涂抹在动物的眼睛上，将适配器放在立体税器上。使用手术刀在头骨上下垂地进行皮肤切口，并在立体轴框架的操纵器上安装钻头。降低钻头，直到它轻轻触摸 lambda，并重置钻头的 DV 坐标为零。

然后，将钻头移动到布雷格玛，以将 AP 和 ML 坐标重置为零。将钻头从啤酒从啤酒移到垂直坐标。将钻头降至头骨，然后再次将 DV 坐标设置为零。

重复第三个坐标的过程后，在目标坐标处小心钻一个毛刺孔，然后在骨骼的相反侧钻第二个孔。将骨螺钉插入第二个孔，并将锁块从 1.5 毫升微离心管盖放在头骨上，使毛刺孔位于圆内。接下来，在立体声适配器的短臂上放置一个导轨，用盖螺母固定管。

将立体声轴的较长臂放在电极夹上，然后将臂连接到立体机械装置的操纵器上。将操纵臂上的 DV 立体轴组件旋转 12 度，然后将导轨杆移动到毛刺孔。然后，慢慢地将导管下到大脑中1.2毫米。

将牙科水泥添加到牙冠上，直到导管、骨螺钉和任何裸露的头骨的金属部分被覆盖和固定，让水泥变干。12 到 20 分钟后，从电极夹上卸下立体声轴适配器，卸下盖螺母，然后用虚拟探头更换立体声适配器。然后，重新发毛帽螺母，将鼠标从立体技术装置中释放出来，将鼠标单独放在单独的笼子里。

在进行微透析之前，用蒸馏水填充一次性一毫升注射器，并使用维顿管将注射器连接到微透析探针的插座。手动盖住通风孔，轻轻按下注射器柱塞，将探针注入水。确认探针入口中出现水，并且微透析膜表面有泄漏。

要激活探针，将探针膜淹没在70-100%乙醇中两秒钟，然后进行第二次蒸馏水输液。将连接针连接到一个入口和一条出口管路，然后用新鲜准备的灌注缓冲液装载一次性三毫升注射器。将装有钝端针头的注射器连接到管子的入口端，并使用注射器泵向整个管内加注液缓冲液。

当管已满时，用激活的微透析探头和盖螺母更换入口和出口管之间的连接针，然后将滚管安装到滚轮泵上的出口管中。以每分钟 10 微升启动注射器泵，以每分钟 9.5-9.8 微升启动滚筒泵。现在，将领子放在麻醉导菜植入动物的脖子上，并拆下帽螺母和假探针。

缓慢地插入微透析探针，通过导管，并固定盖螺母。然后，将鼠标放在连接到自由移动系统的笼子中，然后用衣领将鼠标系在一起。至少一小时后，依次停止滚筒泵和注射器泵，重新启动泵，注射器泵设置为比滚筒泵快 20%，并将出口管的自由端放在冷冻分数收集器上，以收集大脑 ISF。

获得适当的实验体积后，取出探针并像刚才演示的一样处理鼠标恢复。与先前的观察一致，当50微摩尔皮克罗毒素通过反向微透析施用时，如清醒的C57B6J小鼠所证明的，与在车辆对照治疗的动物中测量的水平相比，观察到间质内源性tau水平增加。除了药物给药，微透析还可以与其他体内方法（如脑电图记录或光遗传学）相结合，以回答有关神经元活动如何影响 ISF 中基质浓度的其他问题。