We thank Benjamin Knowles, Yan Wei Lim, Andreas Haas, and members of the Viral Dark Matter consortium for their help and constructive input on this manuscript. This research is funded by the National Science Foundation (DEB-1046413) and is part of the Dimensions: Shedding Light on Viral Dark Matter project.

1.准备多表型分析板（MAP）基材，基本培养基，预增媒体和缓冲区<ol><li>请加入50ml 1.0 - 1.25％基板股票。 <ol><li>溶解1.0 - 1.25％（重量/体积）在无菌水中固体基材（热如有必要）。过滤消毒用在RT0.22μm的过滤器单元和存储股的解决方案。在表2中提供了这些实验中使用的基底的实例。 </li></ol></li><li>使250毫升3×基础培养基的所有基片类（碳，氮，硫和磷）。的MOPS（3-吗啉代-1-磺酸盐）基的基础培养基22包含以下内容:1×MOPS（40mM的MOPS + 10mM的曲辛），0.4％甘油*，9.5毫氯化铵 *，0.25毫鼻4 *，1.0毫硫酸镁 *，1.32毫K 2 HPO 4 *，10毫米氯化钾，0.5微米的CaCl 2，5毫摩尔NaCl，6微米的FeCl 3和0.1％（重量/体积）L-阿拉伯糖**（ 表1和2） 。 注:*根据基础培养基这些化合物不包括在内。例如，0.4％的甘油未在碳基础培养基，并在硫基础培养基1.0mM的MgSO 4干燥被替换为1.0mM的MgCl 2的使用。 ** L-阿拉伯糖是针对特定的pBAD诱导启动子载体，pEMB11，这是转化成ARA的- E.大肠杆菌 K-12菌株（BW 27784）23。 <ol><li>该基础培养基的各成分添加到无菌烧瓶中，并把溶液体积。拌匀。用0.22微米的过滤器单元，过滤器灭菌每个基础培养基到无菌瓶中。 </li></ol></li><li>制成500毫升的MOPS预生长培养基。基于MOPS预生长培养基22包含以下内容:1×MOPS（40mM的MOPS + 10mM的曲辛），0.4％甘油，9.5 mM的氯化铵 ，0.25毫鼻4，1.0mM的MgSO 4干燥，1.32毫K 2 HPO 4， 10mM的氯化钾，0.5微米的CaCl 2，5mM的NaCl和6微米的FeCl 3。 <ol><li>每添加预生长培养基到无菌烧瓶组分和定容。过滤消毒用0.22微米的过滤器单元，然后在100微克/ ml的终浓度添加氨苄青霉素。在4°C储存解决方案。 </li></ol></li><li>请500毫升0.5X卢里亚BERTANI（LB）琼脂平板。到无菌烧瓶中，添加的LB组件，使一个0.5×浓度（1.25克酵母提取物，2.5克氯化钠2.5克胰蛋白胨，7.5克琼脂）。拌匀，高压灭菌消毒。 <ol><li>凉爽的琼脂，然后加入抗生素氨苄青霉素100微克/毫升并混合。直到需要倒〜25毫升琼脂入培养皿，允许设置，并储存在4℃。 </li></ol></li><li>使250毫升的10毫摩尔Tris（pH7.4）中加10毫硫酸镁缓冲溶液。过滤消毒用0.22微米的过滤器单元，并在室温下存储的解决方案。 </li></ol> 2.制备细菌细胞悬液<ol><li>准备新鲜的殖民地。从12.5％甘油冷冻股票，板块新鲜E.大肠杆菌酷龙西文到含有100微克/毫升氨苄青霉素的0.5倍的LB琼脂上。在37℃下放置24小时。 </li><li>准备液体培养: <ol><li>吸管含有100μg/ ml氨苄青霉素到培养管3毫升预生长培养基。对于每个克隆，利用生物一式三份。 </li><li>从接种2.1节独立的殖民地进入准备培养管。在37℃振荡22小时。 </li></ol></li><li>颗粒和洗细菌细胞: <ol><li>转让O / N培养成1.7毫升离心管。通过离心以最大速度（16900×g离心），用于在一个微量离心2分钟沉淀细胞。滗上清，通过重新悬浮于500微升10毫摩尔Tris / 10mM的硫酸镁缓冲洗细胞。重复。 </li><li>重新沉淀细胞，澄清上清液，以1毫升的10mM Tris / 10mM的硫酸镁缓冲重新悬浮细胞。 </li></ol></li><li>测量细胞密度并浓缩细胞（如有必要）: <ol><li>从稀释2.3.3节细胞的10倍在10毫摩尔Tris / 10mM的硫酸镁缓冲液和该稀释转移到一个试管中。测量光密度这种稀释和记录（OD 600纳米 ）。 </li><li>浓缩细胞达到0.07（OD 600纳米 ）中的MAP的最终浓度（细胞将稀释15倍时，他们被加入到的MAP，因此细胞必须在OD 600nm处 = 1.05的初始浓度）。转浓细胞悬液到水库和保存（室温），直到地图准备步骤3.5。 </li></ol></li></ol> 3.制备多表型检测板（MAPS） <ol><li>标签地图。标签无菌96孔微量滴定板与大肠杆菌大肠杆菌克隆识别号码和地图概略类型。 </li><li>分装无菌水成地图。无菌转移无菌水成液体贮存。吸管60微升成使用多通道移液器将微滴定板的每个孔中。 </li><li>分装基础培养基INTØ地图。无菌转移3×基础培养基变成液体贮存。吸管将50μl成使用多通道移液器将微滴定板的每个孔中。重复步骤3.2和3.3中所述MAP概略使用的每个基本培养基。 </li><li>分装到基板的地图。转移30微升每个基片的成MAP的相应孔。 </li><li>加入菌悬液的地图。转移10微升的细菌细胞从节2.4.2成使用多通道移液器在MAP的每个孔中。重新引入吸前更改提示回到文化的股票。 </li><li>覆盖地图与粘合膜。覆盖每个板单粘性板片。用力按下该膜之上的板的孔中，并沿着边缘以创建一个偶数和密封。从微滴定板的用无菌刀片的边缘除去多余的薄膜。 </li><li>测量MAP的光密度: <ol><li>放置制备的MAPs中的多板分光的"输入"套筒光度计板读者。开闭板阅读器软件，并创建一个协议，其测量吸光度（OD 600 nm）的每30分钟，共32个小时，用60秒的读出之间振荡的。 </li><li>设定温度的装置，以37℃。启动协议，一旦地图都平衡到设定温度。 </li><li>后32小时，从板块读者的"输出"袖删除地图。每个标签数据文本文件，包括:E.大肠杆菌克隆的识别号码，日期在MAP跑，并且MAP概略类型。 </li></ol></li></ol> 4.多表型检测板（MAPS）加工参数<ol><li>评估使用自动化QA流程， 例如，PMAnalyzer 24的生长曲线。 <ol><li>验证增长曲线有OD 600纳米 &lt;前2小时0.20。在初始时间点（叔0）在过滤器中不使用吸光度由于冷凝的工件，通常解决在T 1（30分钟）。 </li><li>删除违反质量保证过滤器的增长曲线。保存曲线信息（样品名称，以及数量和OD 600nm的值），以备日后参考一个单独的输出文件。继续分析，如果生长曲线通过QA过滤器。 </li></ol></li><li>计算平均生长曲线。采用复制数据，每口井，通过取中位数光密度（OD 600 nm）的值在每个时间点计算平均增长曲线。记录造成供将来使用一个单独的输出文件中位数的生长曲线。 </li><li>计算使用提出Zwietering 25的方程的自适应每个生长曲线的最佳拟合逻辑模型。逻辑方程包括三个参数描述细菌生长:滞后时间，λ（小时），增长的最大速率，μ 最大 （OD 600nm处 100 -1），和最后的生物量产率，α（OD 600纳米 ）。用数据在时间= 30分钟（Y 1）为<html>由于凝结的文物初始值。 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/52854/52854eq1.jpg" /> [1] <ol><li>计算使用的是直接搜索的最大生长速率。记录变化的最大速度在数据中的90分钟间隔。 <img alt="公式（2）" src="/files/ftp_upload/52854/52854eq2.jpg" /> [2] </li><li>通过搜索最大移动平均值超过90分钟窗口上部渐近值估计的最终生物质产量。具体地讲，定义为生长曲线的渐近线。 <img alt="公式3" src="/files/ftp_upload/52854/52854eq3.jpg" /> [3] </li><li>使用μmax和来自4.3.1和4.3.2的值，发现通过尝试所有λ值的λ值: <img alt="公式4" src="/files/ftp_upload/52854/52854eq4.jpg" /> [4] <ol><li>使用每个λ值来计算误差平方（SSE）的总和。用最低的SSE是SSE（λS）: /files/ftp_upload/52854/52854eq5.jpg"/&gt; [5] </li></ol></li></ol></li></ol> MAP的表型5.分析<ol><li>计算增长水平（GL）的每个生长曲线来评估每个克隆每个基板的整体增长。 GL定义为转向物流，拟合值的调和平均值: <img alt="方程6" src="/files/ftp_upload/52854/52854eq6.jpg" /> [6] </li><li>分配一个表型的基础上的GL值的每个的生长曲线。这里，使用的四种表型是:预期的增长，没有增加，功能的获得，和功能丧失。 <ol><li>由一个特定的基片上在标准偏差距离平均而言比较在所有克隆生长确定表型。使用该统计信息和最小生长阈指定由生长曲线（ 图1A，B）。图1C提供了表型的分配的例子呈现的表型。 </li><li>定义成长为GL≥0.4（FIGURË1A，B）。定义函数的增益（ 图1C，绿色）作为具有GL&gt;高于平均值，平均&gt;成长门槛两个标准差。功能（ 图1C，红色）的损失被定义为具有一个GL &lt;低于平均值的两个标准差，以及平均&gt;生长的阈值。 </li></ol></li><li>创建基于表型和生长曲线的数据集的可视化表示。 <ol><li>查看增长动力描绘OD 600nm的值作为颜色快速比较多的克隆（ 图2）之间的生长曲线。 </li><li>查看表型分布的基础上生长条件（ 图3）所有克隆之一。 </li></ol></li></ol> 6.建设连续培养装置<ol><li>反应堆港口建设（ 图4A，B）。钻3 1/4英寸的孔，在隔开3/4英寸隔开，在连续培养反应器的盖。 <ol><li> FOR气口α:螺纹阴路厄螺纹式的面板安装到1/16英寸的倒钩与倒钩朝上，出了帽盖的底部。安全倒钩用1/4英寸面板安装锁紧螺母。 </li><li>对于端口β:螺纹阴路厄螺纹式的面板安装到1/16英寸的倒钩与倒钩朝上，出了帽。安全倒钩用1/4英寸面板安装锁紧螺母。 </li><li>对于端口γ:螺丝阴路厄螺纹式的面板安装到1/16英寸的倒钩从盖的底部，所以倒钩朝上，出了帽。安全倒钩与1/4。面板安装锁紧螺母。螺杆阳路厄具有整体锁环到1/8。大口径软管倒钩在盖的内侧嵌合。 </li><li>对于流出端口:在钻一个孔5/16在75毫升标记的连续培养反应器。削减3/4。关中1/4的坚果结束。带刺的舱壁配件。拧在1/4。倒钩的隔板接头（垫圈是在瓶的外面和螺母是在里面，女igure 4B）。 </li></ol></li><li>奶瓶港口建设（ 图4C）。钻两个1/4英寸的孔间隔开1英寸相距在奶瓶的盖子。 <ol><li>对于港口δ:一个螺丝母鲁尔螺纹式的面板安装到1/8的倒钩与倒钩朝上，出了帽。安全倒钩用1/4英寸面板安装锁紧螺母。 </li><li>对于港口ε:螺丝阴路厄螺纹式的面板安装到1/16英寸的倒钩与倒钩朝上，出了帽。安全倒钩用1/4英寸面板安装锁紧螺母。 <ol><li>螺杆阳路厄具有整体锁环到1/8。大口径软管倒钩接头，在盖的内侧。 </li></ol></li></ol></li><li>喂食管和管扩展: <ol><li>切两1英寸件管（1/8英寸外径（OD）×1/16英寸的内径（ID））。飞度件到港口α和连续培养反应器的γ在5.2节进行。 </li><li>砍单1英寸一件的T（1/4英寸外径x 1/8英寸ID）ubing。飞度片上连续培养反应器的端口Β。 </li><li>切，管件的单个3.5（1/8英寸外径x 1/16英寸ID）。适合这块到端口γ的内部，在阳路厄带整体锁环到1/8。大口径软管。端口γ是连续培养反应器取样口。 </li><li>砍单1英寸管件（1/4英寸外径x 1/8英寸ID）。适合这块奶瓶的δ端口。 </li><li> （1/16英寸。外径x 1/8英寸ID）的切割。管件单11。适合这块到奶瓶的端口ε的内部，在阳路厄带整体锁环到1/8。大口径软管。 </li><li>切两18英寸的管件（1/8英寸外径x 1/16英寸ID）。适合单件端口ε奶瓶。保存另一片为第7。 </li></ol></li></ol> 7.运行连续培养的代谢组学<ol><li>消毒材料: <ol><li> Autocla已经进行30分钟的干物料。请务必将奶瓶在铝箔第5条提出的上限。保持连接管直。 <ol><li>包装，瓶盖连续培养反应器，在第5条提出的铝箔。保持连接管直。在带18。管切段6.3.5和铝箔最小的蠕动泵管适配器。保持管道直。高压釜30分钟。 </li></ol></li><li>使2升0.5倍LB肉汤。在奶瓶，使0.5×LB培养基。盖上铝箔奶瓶。高压釜1小时。 </li><li>请加入70ml 0.5X LB肉汤。倾肉汤到连续培养反应器中。放置在连续培养反应器搅拌棒。覆盖反应器箔和高压釜30分钟。 </li></ol></li><li>连续培养设置: <ol><li>菌体悬浮液。 <ol><li>从12.5％甘油冷冻股票，板块新鲜E.大肠杆菌克隆在含有100μg/ ml的氨苄青霉素的0.5倍的LB琼脂上。孵化在37℃下24小时。 </li><li>接种单个菌落到含有100微克/毫升氨苄青霉素3毫升的0.5×LB肉汤。对于每个克隆使用生物一式三份。在37℃振荡22小时。 </li></ol></li><li>连接部分组合在一起。 <ol><li>将所有材料蒸压成生物安全柜，打开紫外线灯上，而媒体的冷却。一旦媒体冷却，加入0.1％L-阿拉伯糖和100μg/ ml氨苄青霉素的所有0.5×LB肉汤。 </li><li>解开连续培养反应器盖和螺钉上的反应器中。避免接触采样管。解开馈送瓶盖拧到奶瓶。避免接触采样管。 </li><li>保持18 in油管连接到端口ε无菌。取消包裹18 in油管和蠕动泵管适配器。 </li><li>适合在18的自由端。管到蠕动泵管适配器的一端。适合蠕动泵管适配器的另一端18 in油管连接至端口ε馈送瓶盖。 </li><li>螺杆0.22微米的过滤单元到港口β和连续培养反应器δ。螺杆0.22μm的过滤器单元端口α的适配器上。到0.22微米的过滤装置，适合18的油管的自由端。 </li></ol></li><li>开始连续培养。 <ol><li>在生物安全罩，接种连续培养反应器100微升O / N培养的第7.2.1.1节进行。 </li><li>连续培养进入一个37℃的孵化器前，请关闭系统。在孵化器有磁力搅拌板和迷你蠕动泵设置。 </li><li>适合蠕动泵管适配器插入蠕动泵。从奶瓶管开始在"以"侧和管道，导致反应器中开始于"停止"侧。 </li><li>设置蠕动泵:"快速"。通过切换到R开始蠕动泵20; FORWARD"。检查媒体开始流过管路。 </li><li>将反应器上的磁力搅拌板，并开始搅拌。连续培养反应器必须平衡取样前24小时。 </li></ol></li><li>采样的连续培养。拧5ml的鲁尔乐注射器端口上γ和拉起文化4.5毫升<ol><li>用文化的500微升测量密度（OD 600纳米 ）。稀释的细胞，使4×1毫升培养在OD 600纳米 = 0.35。 </li><li>稀释分装成文化1.7毫升离心管。重复采样，每12小时4天。 </li></ol></li><li>准备样品GC-TOFMS: <ol><li>通过离心沉淀细胞以最大速度（16900×g离心）2分钟。倒出上清液。用500μl磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞。重复此步骤。 </li><li>滗析上清液，最后一次，然后淹没离心管与沉淀的细胞在液氮中直到鼓泡停止。 S撕毁-80样品℃的冰柜。 </li></ol></li></ol></li></ol> 8.运行串行通道分批培养的代谢组学<ol><li>准备细菌细胞悬液。从12.5％甘油冷冻股票，板块新鲜E.大肠杆菌含有100微克/毫升克隆到0.5倍的LB琼脂 氨苄青霉素。在37℃下放置24小时。 <ol><li>接种单个菌落分为3毫升含100微克/毫升0.5×LB肉汤 氨苄青霉素。利用生物一式三份的每个克隆。 </li></ol></li><li>串行通道分批培养。 <ol><li>通过500倍稀释到含有50μg/ ml氨苄青霉素和0.1％L-阿拉伯糖3毫升LB肉汤中传代培养O / N从8.1.1。亚文化应该有一个外径600纳米 &lt;0.005。在37℃振荡。 </li><li>检查光密度（OD 600 nm）的在2和2.5小时。细胞生长达到OD 600纳米 = 0.35。 <ol><li>通过500倍二亚文化lution入含有50μg/ ml氨苄青霉素和0.1％L-阿拉伯糖3毫升LB肉汤中。亚文化应该有一个外径600纳米 &lt;0.005。 </li></ol></li><li>检查光密度（OD 600 nm）的在2和2.5小时。细胞生长达到OD 600纳米 = 0.35。 </li></ol></li><li>抽检连续传代分批培养。 <ol><li>使用无菌镊子，将一个0.22微米的膜过滤器上的过滤器歧管的顶部。分装1毫升磷酸盐缓冲液（PBS）的到滤纸上，然后接通真空泵。 </li><li>重复加入1ml PBS中。转移1毫升亚文化从8.2.3节到滤纸上。从这里出发，迅速采取行动，立即得到样品进入液氮。在1分钟内完成这一点。 </li><li>等分试样1ml的PBS中在滤纸上洗样品。迅速冲洗没有蔓延样品超过滤纸两侧。重复。 </li><li>使用无菌镊子代替过滤器进入1.7 ml离心管小心地折叠网络过滤器。淹没在液氮离心管至起泡停止。在-80℃冷冻存储样本。 </li></ol></li></ol> 9.代谢物分析与处理<ol><li>每船克隆3的样品上干冰到代谢组学核心设施来样加工，分析和GC-TOFMS正常化。 </li><li>对于每个样品确定的平均数，中位数，标准跨代谢变化的偏差和系数，采用复制数据。 </li><li>进行统计分析，使用条件语句和重复执行26去除代谢产物不遵守规定的条件手工编码一个QA管道。 <ol><li>对于条件1，除去代谢物，其中2个以上的样本具有零丰度。从代谢的配置文件删除内部标准。 </li><li>对于条件2，除去那些没有在感兴趣的细胞中发现的代谢物。在这里，删除以下代谢产物:吲哚乙酸3，dihydroabiet<html>集成电路，十九烷酸，水杨酸，水杨醛，胆甾醇，酚，1-单硬脂酸甘油酯，十八烷醇，1-甘油一棕榈酸酯，十二烷，十二烷醇，1-十六烷醇，5-甲氧基色胺，苯甲酸，十五烷酸，磷酸，壬酸，棕榈酸，癸酸，羟胺，硬脂酸，肉豆蔻酸，马来酰亚胺，左旋葡聚糖，和4-羟基丁酸。 </li><li>对于条件3，删除这些代谢产物的变异系数大于1。 </li></ol></li><li>通过观察代谢物的相对丰度捕捉全球代谢的影响。 <ol><li>创建每个克隆的平均代谢物丰度为每个代谢物（ 图6）的可视化表示。 </li></ol></li><li>通过观察克隆代谢产物对频率识别异常值。 <ol><li>计算的Z分数为每个代谢物在克隆的每个中间值。计算使用下面的等式z值: /52854/52854eq7.jpg"/&gt; [7] 注意:字词X MC表示特定代谢物的特定克隆的丰度水平。术语μC表示所有克隆的特定代谢物的平均值。长期σC是相关的标准偏差。 </li><li>创建在其中离群突出显示的数据的可视化表示（未提供数据）。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

在这里，我们提出phenomic的方法推定噬菌体基因的功能特性。技术包括一种能够监控主机同化代谢开发的试验中，多表型分析板（MAPS），除了已建立的代谢的方法，能够测量作用于分解代谢的。我们提供了更多的工具来管理这些技术所产生的大数据集，允许高吞吐量处理和分析24。最后，通过注释的噬菌体衣壳蛋白，硫氧还蛋白噬菌体，两个推定代谢噬菌体的基因，平均响应实验的比较，我们提出各种策略来解释两个数据集和基因类，重点是识别表型的发展趋势和识别异常值的。 如前所述，这两种方法定量测量只有一半宿主代谢。为了解释任何的相对功能根据调查的新的蛋白质，从两种方法的数据是必需的，以提供的功能的证据。虽然这不是我们目前的手稿的一个重点，从每个phenomic方法，数据输出是通过组合的分析，重点集群技术，如随机森林和主成分分析投入。此外，从组合分析所得的假设必须随后通过传统的遗传方法验证。 最后，该方法提出了被很大程度上受到细菌生理学的影响，因此，按照同样的标准。当进行这两种方法，考虑需要进行，以确保独立，克隆群体试行;污染预防;一个单可变正在测试;和适当的控制正在同时运行。如果不考虑这些问题会导致不明确的结果，类似于任何生理检测。 多表型检测板（MAPS） MAP的发展提供了高通量和适应性强的测定相比现有技术（ 图5A和表1,2）。该测定法使用的用品，设备，和基本技术，可以在所有微生物学实验室。一个计算管道的掺入，PMAnalyzer 24，用于随后的数据处理和分析，确保快速的数据解析。另外，该方法的两个实验和分析方面可容易地调节或调谐定制的目的。例如，如果数据的相当大的比例没有通过在部分4中概述的过滤，可以通过手动的生长曲线筛选，以确定问题。如果问题的产生是由于严格的滤波器参数，调整该脚本可。或者，如果问题都与实验过程相关（ 即凝结时间延长;不当细菌转移的CELLS等），那么附加的重复，可以容易地重复。 作为奎瓦斯等 24所描述的，PMAnalyzer是写成一个执行的解析和分析脚本作为一个有凝聚力的，自动化的流水线包装脚本一个bash程序。所有脚本都从一个Git仓库通过取中值跨数据一式三份每个时间点可以自由进出，25，随后参数化物流曲线获得的滞后时间，最大的增长速度，渐近线，以及一个新的名词，增长水平。的中间值被选择了的平均值在我们的研究中，以减少大型离群的效果，然而，该脚本可以容易地适于计算复制数据的平均值。由于减少了变化（SE）看到对面复制数据（ 图2A），我们维持使用中的PMAnalyzer中位数为拟合逻辑曲线。此外，在该研究的切断成长（GL≥0.4）为DETE通过比较数据跨增长水平和最大生长速率如何分离rmined（ 图1A，B）。根据所用这个词可能会有所不同的仪器和模型系统，要求重新界定这一对临界值。 我们的测定法的主要优点是能够比较使用单一参数表征整体微生物的生长，我们定义为生长水平（GL）的表型的能力。 GL是调和平均，并因此减轻了大的异常值的数据的影响。使用调和平均移与物流配值以提供经济增长的总结乃通过试验和错误。其他方法试图区分生长包括:花费的时间达到特定的曲线参数（半μ 最大值，μmax和承载能力），确定（R 2）的系数，以及R 2乘以特定曲线参数的组合。使用调和平均值与移为总帐物流入值提供的最大范围在评价生长，从而它成为所选择的方法。一个考虑需要注意的是动态增长曲线图案具有使用一个参数或拟合模型时，丢失的可能性。例如，该逻辑曲线和GL的各个曲线的参数是不能代表双相生长。在一个单一的碳的环境中，对生长这种效应意味着病毒蛋白的调解对底物利用衬底或转移的任一转换。在不考虑多个生长参数可能丢失的附加效果包括:延长滞后时间，建议病毒机器或产品的负担增加;迅速加快指数阶段，建议连接到主机的能源生产途径的病毒蛋白;或更高水平的生物质的形成，这意味着在主机养分吸收，同化病毒载体（数据未显示）。因此，新生绘制生长曲线（ <st荣&gt;图2A，B）提供了关于长期趋势的信息，而GL考虑到逻辑模型的主要变量，提供一个单一的量化数字来表示一个克隆的整体成功。 当考虑贡献的在MAP的结构和代谢的基因的不同反应，可以观察到有问题的不同的衬底类提供了蛋白质功能的最大证据。例如，代谢的蛋白质通常与采集限制性营养物质，这些都是非特异性主机中心代谢16,32相关联。初步的MAP实验表明，克隆窝藏推定代谢噬菌体基因都具有增加的滞后期上中心代谢的碳源（ 图2A）上生长时。相反，克隆携带假定结构基因，这需要主机和能源的dNTP池的大比例，导致对增长百分之假阳性反应拉尔和氨基酸代谢的碳底物。这可能是由于导致宿主丝状和/或包涵体不溶性蛋白质的积累，通过显微镜（ 图2A和数据未显示）所观察到的。同时进一步分析，以验证这些初步结果，该地图是能够检索的关联到具体的假设基因噬菌体类的功能表型反应。 除了未知病毒蛋白的澄清，地图是一种新颖的资源调查个体细菌的功能和代谢多样性或细菌的群落。地图部件的设计，便于改造支持一系列细菌的生长;包括海洋，营养缺陷型和厌氧微生物。为了便于这些努力已定义的基底和预生长培养基需要额外的或调节的化学物质之前，不同的细菌属可以在MAP中得到支持。在此使用的MAP的一个音符是维持确定的培养基，禁止使用的成分，如蛋白胨​​，酵母提取物和蛋白胨。 代谢组学代谢组学的领域是依赖于代谢物数据库，其中包括通过质谱法鉴定分离的代谢物。这里所选择的核心设施具有最大代谢数据库之一。有趣的是，有一半以上来自我们experimentations产生的代谢物是不可识别的（〜65％），而其他人以前从未被记录在我们的宿主大肠杆菌 （例子包括:吲哚3乙酸33，水杨酸34，和二氢松香酸35）。这一事实可能归因于对植物的代谢物，或所研究的特定蛋白质数据库的任一强烈的偏见。无论如何，结果是已知的可用于数据表示和分析代谢物的数量有限。在福TURE，使用各种数据库的多个代谢组学方法将允许更大范围的代谢物。 目前，已知的和比较和对比了新颖的病毒蛋白时未知的代谢物被使用。使用这种方法，我们假设克隆窝藏功能相似的蛋白质将分享他们的完整代谢轮廓增加相似性。初步代谢分析显示，而结构和代谢基因不明确地互相分离，这些基因表现出在主机上类似的效果，当过量表达不相关（ 图6）。例如，注释的衣壳基因簇紧密地与推定代谢基因在这项研究中，EDT2440和EDT2441突出显示。使用公众可用的跨膜拓扑结构和信号肽预测程序调查显示的证据表明，这两个推定代谢基因窝藏一个跨膜结构域。有趣的是5日出来的Ë9个克隆的第一个群集组（最左边的树状图的部分）的预测使用相同的拓扑结构方案跨膜结构域。需要进一步的研究，但是，它很可能是这些克隆的过度表达期间存在的代谢物与细胞应激反应从膜或结构性负担所得相关联。这方面的证据支持，虽然代谢数据具有噪声的增加量，该方法能够突出，区分基因的一般效果，无论是在和跨基因类信号。为了确定所述方法是否能够提取出的基因功能的特定信息的，代谢物被分为特定的代谢途径。该假说的存在，如果一个克隆影响特定于单个通路的​​代谢产物，然后过表达的基因是激活该途径。在此之前，我们建立了代谢组学的质量保证管线，初步数据显示，有超过一ð代表性不足的代谢产物是典型的"未知"，对与其相关的通路提供的信息很少（数据未显示）。预处理代谢数据，但是，发现，大多数人的代谢物轮廓相似，只有未知和已知代谢物的丰度的选定数量跨越克隆有所不同，例如腐胺和尿嘧啶（ 图6）。以提供蛋白质的功能的努力的更大的分辨率正在作出通过实验与已知的噬菌体的基因，其可以用于填充在代谢物的基础功能表征的"洞"比较新颖的噬菌体基因。使用这种技术，已知的病毒基因所分配的功能提供的未知基因的功能的基准。尽管如此，代谢组学分析的限制因素是数据库的大小和相关性。为了纠正这些限制，听上去很像这项研究代谢数据库需要开发;这样作为代谢产物的特定对大肠杆菌的ASKA收集数据库及其丰度大肠杆菌克隆在其中的单个的ORF过表达36。在2013年提供了这样的数据库需要证据时，研究人员在Lawerence伯克利国家实验室编制具体型号细菌37的整个突变体文库代谢产物的第一个全面的数据库。这项研究提供了新的洞察需要利用特定的代谢物基因，揭示表型和基因型之间的明确联系。 当考虑代谢作为一种工具，重要的是要确定的处理机制，随后在核心设施。大多数实验步骤的工件与使用的仪器有关的一天到一天的差异。迄今所有的GC-MS分析实现利用了包含在每个分析跑内部标准;然而，除了项目具体的内部样品的&lt;/ em&gt;的运行试验中的每一天额外的去除变异。这些因素必须尽早解决，以避免正常化的问题和偏见。另一种解决方案是处理所有样品在同一机器上的核心设施，作为一个单一的批次，在任何核心设施可用的选项。 各种工具都推出并重新探讨这个手稿提供新的手段，筛选和鉴定未知功能的基因的噬菌体。的实验技术与流线形使用计算管道的简单性和适应性，保证这些方法可应用于广泛的研究工作和领域。我们的目标是，这里介绍的方法phenomic将有助于在新的除蛋白噬菌体进一步调查，他们也都同样在功能上不确定的系统。

即感染细菌（又名噬菌体或噬菌体）的病毒，估计存在于全局超过10 31病毒样颗粒（VLP）和多于所有其他生物体中的环境1,2-。第一个宏基因组研究，调查海洋环境相关的病毒社区集中于量化病毒部分3中看到的多样性。此外，布赖特巴特和他的同事发现，病毒序列社区65％以上没有共同的同源性在公共数据库的任何序列。随后的宏基因组的研究发现了类似的证据:从圣地亚哥海洋沉积物宏基因组，加州含有75％的未知病毒序列4;从索尔顿湖的高盐度湖泊宏基因组含有98％的未知病毒序列5;和珊瑚相关的宏基因组含有95 - 98％的未知病毒序列6。未注释的信息这种累积导致噬菌体的遗传物质是7"生物宇宙的暗物质"。 噬菌体的基因组的表征依赖于通过对现有的核酸和蛋白质数据库的比较确定序列相似性。因为噬菌体编码的遗传信息主要是未知的，同源性为基础的方法是无效的。在其基因组中，噬菌体通常编码三个主要基因类型:转录和复制的基因，代谢基因和结构基因。转录和复制的基因（类I / II基因8）包括聚合酶，primases，内/外-核酸酶，和激酶。这些基因是高度保守的，由于其在噬菌体感染的重要性，转录和复制的噬菌体遗传物质。噬菌体聚合酶容易地用传统的序列同源性的方法，由于其全球保护9确定并已显示出作为有效的系统发育标记物10。相比之下，噬菌体代谢和结构基因（II / III级基因8）越来越发散，往往标注为假想的基因。 噬菌体代谢基因影响宿主的代谢能力，并且不一定需要病毒复制。这些基因中，常常被称为辅助代谢的基因11（AMGs），出现以调节宿主代谢，并允许感染和病毒粒子的成熟的成功的最佳发展。 AMGs已用限制性营养或能量生产途径的利用和吸收有关。一些实例包括在各个噬12-16的基因组中发现的光系统的基因，基因连接并通过磷代谢17,18，和利用戊糖磷酸途径噬菌体的dNTP生物合成18,19的调节。相比之下，结构基因是中期到感染过程中产生的晚期基因之间以及在不同的噬菌体浩变化ST制度。结构蛋白的生产依赖于病毒的dNTP的可用性，以及它们的转录，翻译和组件8能池。衣壳和尾部纤维结构蛋白被认为是最发散的所有病毒蛋白编码基因和所需的成功的病毒粒子的生产。他们的分歧通常归因于它们在塑造病毒与宿主协同进化20起到积极的作用。发散的蛋白质，无论基因类的，很容易用传统的同源性和序列比对技术时忽视。为了纠正见过严格序列比较的局限性导致了能够使用的序列特征来判断的关联，如人工神经网络21的生物信息学工具。人工神经网络（人工神经网络）允许的结构和代谢基因的预测，但是，需要下游实验验证直接表征基因的功能。 本手稿的目的是提供一种能的新型噬菌体基因的表达过程中监测宿主细菌的两个分解代谢和合成代谢的代谢phenomic协议，功能通过人工神经网络的预测。组学的领域中，与细胞的表型相关的生物，是公认的在系统生物学中的蛋白质与未知或多效性功能的调查中提供帮助。 Phenomic工具用于表型信息链接到基因型信息。我们推测对它们的功能（多个）可以通过噬菌体基因表达过程中观察宿主的生理效应来确定推定的噬菌体基因。为了调查这一假设，两轮量化方法进行选择。多表型分析板（MAP中）被用来监测宿主底物利用和随后的生物质形成，而代谢测定宿主代谢物的多样性和相对丰度的增长在特定ENVIRON期间精神状态。推定的结构和代谢蛋白过表达在大肠杆菌中，并从两个实验的代表性结果进行了比较。众多的视觉技术和高通量处理管道呈现，以方便实验复制。最后，对所提出的方法的再现性和精度的预期生理效应一个被注解衣壳蛋白和噬菌体代谢蛋白，硫氧还蛋白，加上两个推定AMGs的上下文中讨论。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;micro;m Sterivex Filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>SVGP01050</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m Millex Filters</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLGV033RS</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m SteriCap Filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGPS02RE</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m Omnipore membrane filters</td><td>Millipore</td><td>JHWP02500</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>96-well micro-titer plates</td><td>VWR</td><td>82050-764</td><td>Standard F-Bottom 96 well Microplates</td></tr><tr><td>2 ml 96-well plate</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhesive seal plate film</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z369667</td><td></td></tr><tr><td>2 L Nalgene square bottles</td><td>Cole Parmer</td><td>T-06040-70</td><td></td></tr><tr><td>125 ml Nalgene square bottles</td><td>Cole Parmer</td><td>T-06040-50</td><td></td></tr><tr><td>1/4 in. Panel mount lock nut, black nylon</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45509-04</td><td></td></tr><tr><td>Female Luer thread style panel mount to 200 Series Barb, 1/16 in.</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45500-30</td><td></td></tr><tr><td>Female Luer thread style panel mount to 200 series barb, 1/8 in.</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45500-34</td><td></td></tr><tr><td>Male Luer integral lock ring to 500 series barb, 1/16 in. ID tubing</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45505-31</td><td></td></tr><tr><td>Male Luer with lock ring x female Luer coupler</td><td>Cole Parmer</td><td>T-45508-80</td><td></td></tr><tr><td>Barbed bulkhead fittings, 1/4 in. OD</td><td>Fisher Scientific</td><td>6149-0002</td><td></td></tr><tr><td>Sanipure tubing, 1/16 in. ID x 1/8 in. OD</td><td>SaniPure</td><td>AR400002</td><td></td></tr><tr><td>Sanipure tubing, 1/4 in. OD x 1/8 in. ID</td><td>SaniPure</td><td>AR400007</td><td></td></tr><tr><td>Variable flow mini pump (peristaltic pump)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-1</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td>Velp Scientifica</td><td>F203A0160</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-141</td><td>Millipore* Filter Forceps</td></tr><tr><td>Multi-plate spectrophotometer plate reader</td><td>Molecular Devices Analyst GT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter manifold</td><td>Fisher Scientific</td><td>XX10 025 02</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software:</td></tr><tr><td>Python version 2.7.5</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.python.org/&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://www.python.org/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PyLab module</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://wiki.scipy.org/PyLab&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://wiki.scipy.org/PyLab&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>R version 3.0.1</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.r-project.org/&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://www.r-project.org/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>reshape2 library</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://had.co.nz/reshape&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://had.co.nz/reshape&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>ggplot2 library</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://ggplot2.org/&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://ggplot2.org/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Gene Composer</td><td>PSI Tech Portal</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.genecomposer.net&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://www.genecomposer.net&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">Services:</td></tr><tr><td>West Coast Metabolomics Center</td><td>UC Davis</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://metabolomics.ucdavis.edu/&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://metabolomics.ucdavis.edu&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>DNA 2.0</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://www.dna20.com&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;https://www.dna20.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

phage phenomics: physiological approaches to characterize novel viral proteins

目前的调查到噬菌体 - 宿主相互作用依赖于从（甲基）基因组推断的知识。有趣的是，60 - 噬菌体全部序列的95％的市场份额没有同源性为当前注释蛋白质。其结果是，噬菌体的基因有很大一部分被注释为假设。这一现实严重影响了结构性和辅助代谢基因的注解。在这里，我们提出旨在捕捉所选主机的这些未知的噬菌体基因中的表达过程中的生理反应（S）phenomic方法。多表型分析板（MAP中）用于监控主机底物利用和随后的生物质形成的多样性，而代谢通过监测代谢物的丰度和多样性提供双向产物分析。这两种工具同时使用，以提供一个单一的推定噬菌体开放阅读框（ORF）的表达相关的表型信息。对于这两种方法的代表性结果进行比较，highl照明的宿主携带或者推定的结构或代谢噬菌体基因的表型信息的差异。此外，可视化技术和高吞吐量计算管道，便利实验分析给出。

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Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

噬菌体型组学:生理途径来表征新型病毒蛋白

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

phage-phenomics-physiological-approaches-to-characterize-novel-viral

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.1K 次观看.  San Diego State University. Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

视频: Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

在细胞命运<em&gt; E.大肠杆菌</em感染后的噬菌体λ

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

科研

免疫与感染

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

使用“单个病毒基因组的单病毒颗粒的分离和基因组分析&#39;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel capabilities to perform basic and applied sciences in test tube reactions. Over the past decade, cell-free TXTL has become a powerful technique for a broad range of novel multidisciplinary research areas related to quantitative and synthetic biology. The new TXTL platforms are particularly useful to construct and interrogate biochemical systems through the execution of synthetic or natural gene circuits. In vitro TXTL has proven convenient to rapidly prototype regulatory elements and biological networks as well as to recapitulate molecular self-assembly mechanisms found in living systems. In this article, we describe how infectious bacteriophages, such as MS2 (RNA), &#934;&#935;174 (ssDNA), and T7 (dsDNA), are entirely synthesized from their genome in one-pot reactions using an all Escherichia coli, cell-free TXTL system. Synthesis of the three coliphages is quantified using the plaque assay. We show how the yield of synthesized phage depends on the biochemical settings of the reactions. Molecular crowding, emulated through a controlled concentration of PEG 8000, affects the amount of synthesized phages by orders of magnitudes. We also describe how to amplify the phages and how to purify their genomes. The set of protocols and results presented in this work should be of interest to multidisciplinary researchers involved in cell-free synthetic biology and bioengineering.

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation platforms has been engineered to construct biochemical systems in vitro through the execution of gene circuits. In this article, we describe how bacteriophages, such as MS2, &#934;&#935;174, and T7, are synthesized from their genome using an all E. coli cell-free TXTL system.

传染性噬菌体大肠杆菌-合成基于无细胞表达系统

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

生物工程

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

病毒 DNA 的纯化及相关病毒和细胞蛋白的鉴定

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

<meta charset="utf8"></head><body>使用双报告基因和多重技术分析 SARS-CoV-2

Profiling of Surface Protein Epitopes on Viral Particles by Multiplex Dual-Reporter Strategy

Membrane proteins on enveloped viruses play an important role in many biological functions involving virus attachment to target cell receptors, fusion of viral particles to host cells, host-virus interactions, and disease pathogenesis. Furthermore, viral membrane proteins on virus particles and presented on host cell surfaces have proven to be excellent targets for antivirals and vaccines. Here, we describe a protocol to investigate surface proteins on intact severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) particles using the dual-reporter flow cytometric system. The assay exploits multiplex technology to obtain a triple detection of viral particles by three independent affinity reactions. Magnetic beads conjugated to recombinant human angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2) were used to capture viral particles from the supernatant of cells infected with SARS-CoV-2. Then, two detection reagents labeled with R-phycoerythrin (PE) or Brilliant Violet 421 (BV421) were applied simultaneously. As a proof-of-concept, antibody fragments targeting different epitopes of the SARS-CoV-2 surface protein Spike (S1) were used. The detection of viral particles by three independent affinity reactions provides strong specificity and confirms the capture of intact virus particles. Dose-dependency curves of SARS-CoV-2 infected cell supernatant were generated with replicate coefficient variances (mean/SD) &#706;14%. Good assay performance in both channels confirmed that two virus surface target protein epitopes are detectable in parallel. The protocol described here could be applied for (i) high-multiplex, high-throughput profiling of surface proteins expressed on enveloped viruses; ii) detection of active intact viral particles; and (iii) assessment of specificity and affinity of antibodies and antiviral drugs for surface epitopes of viral antigens.The application can be potentially extended to any type of extracellular vesicles and bioparticles, exposing surface antigens in body fluids or other liquid matrices.

<meta charset="utf8"></head><body>作者聚焦:通过新型免疫捕获和质谱技术推进抗病毒策略

Here, we describe a newly developed multiplex fluorescent immunoassay that uses a dual-reporter flow cytometric system to concurrently detect two unique spike protein epitopes on intact severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) viral particles that had been captured by angiotensin-converting enzyme-2-coupled magnetic microspheres.

通过多重双报告基因策略分析病毒颗粒上的表面蛋白表位

Membrane proteins on enveloped viruses play an important role in many biological functions involving virus attachment to target cell receptors, fusion of ...

使用 T4 噬菌体探索小鼠模型中的肠道噬菌体-细菌动力学

T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across all known ecosystems. Within bacterial communities, such as those found in the gut microbiota, phages are implicated in regulating microbiota population dynamics and driving bacterial evolution. There has been renewed interest in phage research in the last decade, in part due to the host-specific killing capabilities of lytic phages, which offer a promising tool to counter the increasing threat of antimicrobial resistant bacteria. Furthermore, recent studies demonstrating that phages adhere to intestinal mucus suggest they may have a protective role in preventing bacterial invasion into the underlying epithelium. Importantly, like bacterial microbiomes, disrupted phageomes have been associated with worsened outcomes in diseases such as inflammatory bowel disease. Previous studies have demonstrated that phages can modulate the microbiome of animals and humans through fecal filtrate transplants, benefiting the host&#39;s health. With this recent wave of research comes the necessity to establish and standardize protocols for studying phages in the context of the gut microbiome. This protocol provides a set of procedures to study isolated T4 phages and their bacterial host, Escherichia coli,&#160;in the context of the murine gastrointestinal tract. The methods described here outline&#160;how to start from a phage lysate, administer it to mice and assess effects on bacterial host and phage levels.&#160;This protocol can be modified and applied to other phage-bacterial pairs and provides a starting point for studying host-phage dynamics in vivo.

作者聚焦:研究噬菌体诱导的 Gnotobiotic 小鼠免疫反应

Bacteriophages (phages), viruses that infect bacteria, are an integral component of the gut microbiome. Though these symbiotic inhabitants drive bacterial fitness and population dynamics, little is understood about how they impact gut homeostasis and disease. This protocol studies isolated T4 phages within a mouse model, adaptable to other phage-bacterial pairs.

小鼠肠道中 T4 噬菌体和 大肠杆菌 相互作用:研究体内宿主-噬菌体动力学的原型模型

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across ...

噬菌体型组学:生理途径来表征新型病毒蛋白

摘要

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在细胞命运

使用“单个病毒基因组的单病毒颗粒的分离和基因组分析'

传染性噬菌体大肠杆菌-合成基于无细胞表达系统

病毒 DNA 的纯化及相关病毒和细胞蛋白的鉴定

通过多重双报告基因策略分析病毒颗粒上的表面蛋白表位

通过多重双报告基因策略分析病毒颗粒上的表面蛋白表位

通过多重双报告基因策略分析病毒颗粒上的表面蛋白表位

小鼠肠道中 T4 噬菌体和大肠杆菌相互作用:研究体内宿主-噬菌体动力学的原型模型

小鼠肠道中 T4 噬菌体和大肠杆菌相互作用:研究体内宿主-噬菌体动力学的原型模型

小鼠肠道中 T4 噬菌体和大肠杆菌相互作用:研究体内宿主-噬菌体动力学的原型模型

噬菌体型组学:生理途径来表征新型病毒蛋白

摘要

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在细胞命运

使用“单个病毒基因组的单病毒颗粒的分离和基因组分析'

传染性噬菌体大肠杆菌-合成基于无细胞表达系统

病毒 DNA 的纯化及相关病毒和细胞蛋白的鉴定

通过多重双报告基因策略分析病毒颗粒上的表面蛋白表位

通过多重双报告基因策略分析病毒颗粒上的表面蛋白表位

通过多重双报告基因策略分析病毒颗粒上的表面蛋白表位

小鼠肠道中 T4 噬菌体和 大肠杆菌 相互作用:研究体内宿主-噬菌体动力学的原型模型

小鼠肠道中 T4 噬菌体和 大肠杆菌 相互作用:研究体内宿主-噬菌体动力学的原型模型

小鼠肠道中 T4 噬菌体和 大肠杆菌 相互作用:研究体内宿主-噬菌体动力学的原型模型

小鼠肠道中 T4 噬菌体和大肠杆菌相互作用:研究体内宿主-噬菌体动力学的原型模型

小鼠肠道中 T4 噬菌体和大肠杆菌相互作用:研究体内宿主-噬菌体动力学的原型模型

小鼠肠道中 T4 噬菌体和大肠杆菌相互作用:研究体内宿主-噬菌体动力学的原型模型