靶向癌细胞中非编码 RNA 之间合成致死相互作用的双重 CRISPR 干扰策略

本研究提出了一种靶向黑色素瘤细胞中长非编码 RNA 的双 CRISPRi 系统。它支持组合基因敲低和合成致死筛选，为潜在的治疗策略识别癌症特异性 lncRNA 相互作用。

长链非编码 RNA （lncRNA） 代表了一类庞大且功能多样的 RNA 分子，在人类基因组中预测了超过 100,000 个。尽管与蛋白质编码基因相比，lncRNA 在物种间的保守性较低，但它们在基因调控、染色质相互作用和癌症进展中起着关键作用。它们与癌症的参与使它们成为有希望的治疗靶点。CRISPR 干扰 （CRISPRi） 利用催化失活的 Cas9 与转录阻遏物（如 KRAB-MeCP2）融合，为靶向核 lncRNA 和评估其功能提供了一种精确的方法。本研究介绍了一种双 CRISPRi 系统，该系统使用来自 dCas9-KRAB-MeCP2 的金 黄色葡萄球菌 和 化脓性链球菌 的正交 CRISPRi 技术，针对人黑色素瘤细胞中 lncRNA 的组合靶向进行了优化。该方案有助于 lncRNA 对的组合基因敲低或合成致死筛选，为癌症研究提供了一种新的工具。通过探索 lncRNA 之间的合成致死性，这种方法可以帮助识别对癌细胞存活至关重要的 lncRNA 相互作用，从而提供新的治疗策略。展示了双系统的功能，突出了其在识别关键癌症特异性 lncRNA 相互作用方面的潜力。

虽然只有不到 3% 的人类基因组编码蛋白质，但大约 80% 的基因组被转录 ^1,2。在非编码转录单元中，数以万计被归类为超过 200 个核苷酸的长非编码 RNA （lncRNA），人类 lncRNA 的总数估计超过 100,000 个 ^3,4。与编码基因相比，lncRNA 在物种间的保守性较低。鉴于人类与黑猩猩等灵长类动物共享 99% 的基因组，因此假设 lncRNA 对表型进化的影响要大得多 ^5,6。这些发现表明 lncRNAs 的重要细胞功能。尽管 lncRNA 的调节及其与 RNA 结合蛋白和其他 RNA 的相互作用仍不完全清楚，并且许多 lncRNA 尚未完全注释，但很明显，lncRNA 在健康和疾病（如癌症）中表现出细胞和组织特异性表达模式 7,8,9,10。它们涉及多种功能，包括基因转录调控、参与染色质相互作用¹¹、RNA 加工¹²、RNA 稳定¹³ 和翻译调节¹⁴。

在癌症中，高度多样化的细胞类型特异性 lncRNA 通过调节基因表达来影响肿瘤的发展和转移，突出了它们作为有价值的治疗靶点的潜力¹⁵。除了在肿瘤样本中检测作为生物标志物的 lncRNA¹⁶ 之外，靶向肿瘤特异性 lncRNA 以破坏其下游功能在临床应用和基础研究中都具有重要潜力。阐明 lncRNA 作用的基于 RNA 的方法包括反义寡核苷酸 （ASO）、短发夹 RNA 和小干扰 RNA （siRNA）^17,18。虽然 siRNA 通常用于基因沉默筛选，但基于 siRNA 的敲低仅限于细胞质¹⁹。然而，lncRNA 经常在细胞核内起作用。

或者，成簇的规则间隔短回文重复序列干扰 （CRISPRi） 可用于抑制人类癌症中的 lncRNA²⁰。此外，全基因组 CRISPRi 筛选可以很容易地编程并靶向广泛的编码和非编码基因，以检查它们的功能影响^21,22。在 CRISPRi 中，催化缺陷型 Cas9 （dCas9） 与转录阻遏结构域融合，例如 Krüppel 相关盒 （KRAB） 结构域²³。dCas9-KRAB 的基因抑制由引导 RNA （gRNA） 引导至感兴趣区域。CRISPRi 在 DNA 水平上控制基因，与在转录后水平活跃的 RNA 干扰相比，CRISPRi 可实现更高的效率和所需的失调功能表型²⁴。为了应对 KRAB 在靶标沉默中的有限疗效，引入了 KRAB 和 MeCP2 与 dCas9 的融合作为更有效的抑制策略²⁵。

尽管单基因沉默可能会影响癌症活力，但合成的双重或多重致命相互作用可以使癌细胞免于细胞死亡²⁶。合成致死性涉及两个或多个基因，每个基因都可以补偿另一个基因的功能。为了克服单基因敲低筛选的问题，针对致命蛋白质编码基因对的双 CRISPR 策略提供了一种很有前途的方法²⁷。

在这里，我们提出了一种使用金 黄色葡萄球菌 和 化脓性链球菌 dCas9 与人黑色素瘤细胞中的 KRAB-MeCP2 融合的基于正交 CRISPRi 靶向 lncRNA 或其他非编码 RNA 对的方案（见 图 1）。该方案可用于组合经典 CRISPR 敲低或作为癌症中合成致死对的基于 CRISPRi 的筛选。在 CRISPRi 方法中使用两种不同的 dCas9 物种 SpCas9 和 SaCas9，可以独立靶向不同的基因组位点，同时具有最小的交叉反应性，从而提高特异性和灵活性，同时确保高靶向选择性。使用不同的原始间隔区相邻基序 （PAM）： SpCas9 的 NGG 和 SaCas9 的 NNGRRT。双 dCas9 系统通过使用单一类型的 dCas9 时实现精确、同步调制和减少 sgRNA-RNP 复合物竞争，解决了 sgRNA 兼容性受限等挑战。这项创新提高了双 sgRNA 文库筛选的稳定性和多功能性。总之，我们在黑色素瘤细胞中提供了一个功能齐全的双 CRISPRi 系统作为癌症模型。

图 1：双 CRISPRi 系统靶向非编码 RNA 的合成致死相互作用的方案。 （A） 双 gRNA 载体的克隆程序。（B） 用包膜质粒 VSV-G、包装质粒 PAX2 和转移载体转染 HEK293 细胞，以产生慢病毒，用于随后转导到 501-mel 细胞中。将含有 SpdCas9-KRAB-MeCP2 （蓝色） 和 SadCas9-KRAB-MeCP2 （红色） 遗传信息的慢病毒同时整合到 501-mel 细胞中。抗生素选择后，进行第二次慢病毒转导以整合所需的双 gRNA （橄榄绿）。（C） 表达 dCas9 变体的 501-mel 细胞与其相应的 gRNA 相互作用以沉默靶基因表达，导致癌细胞死亡。使用 BioRender.com 创建。 请单击此处查看此图的较大版本。

人黑色素瘤细胞系 501-mel （RRID： CVCL_4633） 由 Aifantis 实验室（纽约大学）友情提供。Lenti-X 293T HEK 细胞系购自 Takara Bio。这些细胞系在 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 （DMEM） 高葡萄糖中培养，该培养基补充有 10% 胎牛血清 （FBS），温度为 37 °C，在 5% CO₂ 气氛中，无菌条件下。传代细胞直至达到 80%-90% 汇合度。定期检测细胞系的支原体污染。

1. 使用在线 gRNA 设计平台设计 gRNA

1. 为每个靶标 lncRNA 设计一个 SpCas9 特异性 gRNA 和一个 SaCas9 特异性 gRNA，以评估哪个变体产生卓越的敲低结果。
2. 靶向所需的 lncRNA，此处为 RP11-120D5.1 （RP11） 和 XLOC_030781 （XLOC），对每个化脓 性链球菌 （gRNA-sp） Cas9 和 金黄色葡萄球菌 （gRNA-sa） Cas9 使用最有效的 gRNA。
   注意： 化脓性链球菌 gRNA 可以从 Petroulia 等人 ²⁸ 中提取。
3. 遵循位点特异性建议，优先考虑最高的靶向活性，以高靶向分数表示，同时按照 gRNA 设计工具的建议最大限度地减少脱靶匹配。
   1. 选择基因组 GRCh38 （hg， Homo sapiens）。选择特定 SpCas9 （NGG） 和 SaCas9 （NNGRRT） 的 PAM 位点。
   2. 使用 Hsu 等人 ²⁹ 的脱靶评分方法。将 gRNA 放置在转录起始位点周围 -150 bp 至 +50 bp 的窗口内，以获得最佳性能。
   3. 选择具有最高脱靶和脱靶评分的 gRNA（参见 补充表 1）。
4. 将针对 Rosa26 的非靶向或加扰对照 gRNA 与每个靶标 gRNA 混合，以创建一个靶向一个 lncRNA 的双 gRNA 载体。将靶标 gRNA 组合在一个质粒中，可以对两个靶标位点进行位点特异性修饰。
   注：含有对照 gRNA 和靶标 gRNA 的双 gRNA 载体能够敲低一个靶标 lncRNA，而含有靶向位点的 gRNA 的双 gRNA 载体可以同时敲低靶向 lncRNA。

2. gRNA 克隆

1. 使用两个含有 gRNA 序列的 DNA 片段进行重叠延伸 PCR。使用 U6 正向引物和 H1 反向引物（参见 补充表 2）进行扩增，如 Najm 等人 ²⁷ 所述。
   1. 用 25 μL 含 HF 缓冲液的 2x 高保真 PCR 预混液和 1 μL 含有 化脓性链球菌 或 金黄色葡萄球菌 gRNA 的 DNA 片段构建 50 μL PCR 反应。在以下循环条件下运行反应：在 98 °C 下初始变性 30 秒，然后在 98 °C 下变性 15 次循环 5 秒，在 55 °C 下退火 10 秒，在 72 °C 下伸长 15 秒。
   2. 完成最初的 15 个循环后，加入 2.5 μL U6 正向引物和 2.5 μL H1 反向引物，并在相同条件下将反应再进行 20 次循环，最终在 72 °C 下延伸 5 分钟。
   3. 根据制造商的说明，使用 PCR 纯化试剂盒纯化 PCR 产物。
   4. 使用 1 μL BsmB1 限制性内切酶和 1 μL 10x 缓冲液在 37 °C 下在 10 μL 反应中消化 1 μg 修饰质粒 30 分钟。
   5. 使用其他人³⁰ 所述的 HiFi DNA 组装反应方案，将 PCR 产物克隆到消化的双 gRNA-Zeo-GFP 质粒中（参见补充图 1 和补充文件 1）。
   6. 根据制造商的说明，通过将 50 μL 细菌培养物与 4 μL 组装产品混合来转化化学感受态大 肠杆菌 细胞。

3. 慢病毒生产

注意：在遵循适当安全指南的同时，在所有步骤中处理活性慢病毒。始终在 2 类安全柜中与病毒一起工作，以防止不可避免的气溶胶形成造成危险。在安全柜外进行所有工作，例如离心，在气密容器和经批准用于风险组 2 生物体的转子中进行。在工作区域始终穿着合适的防护服，包括实验服、一次性手套和安全护目镜。工作表面必须用消毒液处理，其他废物也必须用消毒液处理，让它们在紫外线下在密封柜中保留至少 240 分钟。使用过的血清移液器和移液器吸头必须在消毒液中冲洗，然后才能丢弃在可高压灭菌的瓶子中。之后，废物应丢弃在 S2 废物容器中。S2 废物将通过高压灭菌灭活。转导的细胞系可以在转导后不早于 2 天且至少用无病毒培养基完全更换两次后在 S1 条件下处理。

1. 在血细胞计数器中将 10 μL 细胞与 10 μL 台盼蓝溶液混合，对 Lenti-X 293T HEK 细胞进行计数。每 10 cm 板接种 4 x 10⁶ 个 Lenti-X 293T HEK 细胞，以在第二天达到 ~80% 的汇合度。
2. 从这一步开始在 2 类实验室工作。将 500 μL 合适的转染培养基与 11.25 μg 转染载体 SpdCas9-KRAB-MeCP2（参见 补充文件 2）、5.5 μg 包膜质粒 VSV-G 和 16.5 μg pPAX2 载体混合。在室温下孵育 5 分钟。对于第二个 dCas9 变体，使用转移载体 SadCas9-KRAB-MeCP2（参见 补充文件 3）。
3. 在单独的试管中，将 500 μL 减血清培养基与 36 μL PEI 试剂（原液：1 mg/mL）混合。在室温下孵育 5 分钟。
4. 混合混合物并在室温下孵育 15 分钟。小心地将混合物滴加到细胞培养基 （6 mL） 中，并在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育过夜。确保细胞保持附着，以避免慢病毒产量降低。
5. 12-15 小时后，使用血清移液管将培养基丢弃到可高压灭菌的废瓶中。从现在开始，用消毒剂溶液冲洗耗材，包括血清移液器和移液器吸头，然后再将其丢弃在高压灭菌器废液中。使用新移液器向转染细胞中加入 5 mL 新鲜 DMEM 培养基。
6. 转染后 48 小时，使用血清移液管将上清液转移到 50 mL 经典管中，收获慢病毒。将规范管存放在冰箱中。向细胞中加入 5 mL 新鲜培养基，并将细胞再孵育 24 小时。
7. 通过将上清液转移到包含第一次收获物的同一 50 mL 经典管中，重复慢病毒的收集。再次加入 5 mL 新鲜培养基，孵育 24 小时，然后将上清液转移到 50 mL 经典管中。将第一次、第二次和第三次收获的混合上清液储存在 4 °C 的 50 mL 规范管中，直至过滤和离心。
8. 将混合上清液在 500 x g 和 4 °C 下在经批准用于风险组 2 生物体的气密容器和转子中离心 5 分钟，以沉淀分离的细胞和碎片。通过 0.2 μm 无菌细胞培养级注射器过滤器过滤上清液。
9. 使用离心过滤装置将过滤后的上清液在 1,000 x g 和 4 °C 下浓缩，适当截留分子量为 100 kDa 至约 500 μL。将 50-100 μL 的病毒等分试样储存在 -80 °C 直至进一步使用。

4. 慢病毒转导和稳定转染细胞的选择

注意： 始终在 2 类安全柜中与病毒一起工作。

1. 转导前 1 天，以 2 x 10⁵ 个细胞/孔的速率将 501-mel 细胞铺在 6 孔板中，最终培养体积为 2 mL。
2. 用 2 mL 预热的 DMEM 培养基替换培养基，该培养基补充有终浓度为 6 μg/mL 的聚凝胺。
3. 从现在开始，需要在 2 级实验室工作。同时向细胞中加入 50 μL 含有 SpdCas9-KRAB-MeCP2 和 SadCas9-KRAB-MeCP2 的慢病毒。在将耗材丢弃到高压灭菌器废液中之前，先用消毒剂溶液冲洗耗材，包括血清移液器和移液器吸头。轻轻摇动板，并在 37 °C 和 5% CO₂ 气氛中孵育。
4. 使用血清移液管将培养基丢弃到可高压灭菌的瓶子中，并在转导后 16 小时加入 2 mL 含有杀稻瘟菌素 （10 μg/mL） 和嘌呤霉素 （2 μg/mL） 的新鲜培养基。
5. 2 天后，用含有杀稻瘟菌素 （10 μg/mL） 和嘌呤霉素 （2 μg/mL） 的新鲜 2 mL 培养基替换培养基，继续筛选。转导后 7 天后，在 S1 条件下处理转导的细胞。
   注：必须进行抗生素筛选，直到所有未转导的对照细胞死亡。根据转移载体中的电阻盒，可以使用其他选择策略。如果需要，使用杀灭曲线优化抗生素浓度。可能需要通过流式细胞术或连续稀释和铺板进行详细的单细胞克隆选择，然后进行蛋白质定量，以获得以足够水平表达 dCas9 融合的细胞群。

5. 蛋白质定量和 Western blot 分析

1. 通过在血细胞计数器中将 10 μL 细胞与 10 μL 台盼蓝溶液混合，对稳定转染的 501-mel 细胞进行计数。将 1 x 10⁶ 个细胞在 500 x g 和 4 °C 下离心 5 分钟。 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL 冰冷的 PBS 中。
2. 重复离心并将细胞沉淀重悬于 50 μL 含有蛋白酶抑制剂的 RIPA 缓冲液中。在冰上孵育 15 分钟，并在 4 °C 下以 13,000 x g 离心 10 分钟以去除细胞碎片。 将上清液储存在 -20 °C 或立即用于蛋白质定量，如其他人所述³¹。
3. 将 10 μg 蛋白质与 4 x LDS 缓冲液、50 mM DTT 混合，并用蒸馏水填充至 20 μL。如前所述，通过在 135 V 下使用基于 Tris/甘氨酸的 SDS-PAGE 分离 1 小时，在 10% 分离凝胶上分离蛋白质³²。使用湿式槽转移将蛋白质在 90 V 下转移到 PVDF 膜上 90 分钟。
4. 在室温下将膜在封闭缓冲液（TBS-T 中的 5% 脱脂牛奶）中以 180 rpm 孵育 1 小时。
5. 在封闭缓冲液中加入 1：10,000 抗 GAPDH 小鼠单克隆抗体作为内部对照。在封闭缓冲液中以 1：1,000 的比例稀释加入抗 Cas9（化脓性链球菌）或抗 Cas9（金黄色葡萄球菌）一抗，并在 4 °C 下轻轻摇动孵育过夜。
6. 用 TBST 缓冲液洗涤膜 3 次，每次 10 分钟。在室温下与二抗小鼠 HRP 抗体 （1：10,000） 孵育 1 小时。
7. 用 TBST 缓冲液洗涤 3 次，每次 10 分钟。使用 ECL Substrate 和成像系统检测信号。

6. 双重 LncRNA 抑制活力测定

注意： 始终在 2 类安全柜中与病毒一起工作。

1. 转导后 7 天，在 96 孔板中，在 100 μL 预热的 DMEM 培养基中接种 0.1 x 10^{5 个} 含有稳定转染的 SadCas9-KRAB 和 SpdCas9-KRAB 的细胞，转导前 1 天。
2. 在转导当天，用 100 μL 预热的 DMEM 培养基替换培养基，该培养基补充有终浓度为 6 μg/mL 的聚凝胺。从现在开始，需要在 2 级实验室工作。向细胞中加入适当体积的慢病毒。
   注：必须使用 GFP 检查含有双 gRNA 载体的慢病毒的体积，以通过滴定慢病毒生成线性曲线。
3. 转导后 16 小时，用含有 500 μg/mL Zeocin、5 μg/mL 杀稻瘟菌素和 1 μg/mL 嘌呤霉素的新鲜培养基替换培养基。
4. 根据制造商的说明，在转导后 5 天使用细胞活力测定法进行发光检测。

使用等量慢病毒的转导将 SadCas9-KRAB-MeCP2 和 SpdCas9-KRAB-MeCP2 的表达盒同时整合到 501-mel 细胞中。由于该 CRISPRi 方案依赖于 dCas9-KRAB-MeCP2 变体的表达，因此 Western blot 分析非常适合在蛋白质水平上确认它们的存在。在富集阳性转染细胞后，收集样品进行 Western blot 分析，以确认 dCas9-KRAB-MeCP2 直系同源物的存在。成功转导后，预期并确认对应于 SpdCas9-KRAB-MeCP2 融合蛋白 （202 kDa） 和 SadCas9-KRAB-MeCP2 融合蛋白 （170 kDa） 的单条带，如图 2A 所示，使用对相应 Cas9 直系同源物具有特异性的抗体。但是，如果 Western blot 不可行，则可以使用 qPCR 在 mRNA 水平验证融合蛋白。

一旦产生稳定表达功能性阻遏蛋白的 501-mel 细胞，使用双 gRNA 载体进行第二次慢病毒转导。RP11 和 XLOC 先前被证明在转移性黑色素瘤的短期培养中上调，并且单个 CRISPRi 靶向证明了它们对增殖和细胞存活的影响²⁸。因此，我们选择这个 lncRNA 对作为概念验证合成致死非编码 RNA 组合进行评估，预计在修饰细胞中会有一个累积的、易于观察的生长表型。

为了使用活力测定研究双 CRISPRi 对癌细胞的影响，必须有效抑制两种靶向 lncRNA。qPCR 是通过测量它们的转录水平来确认这种抑制的最合适方法。我们通过确定 RNA 水平并检查靶向可能致命的 RP11 和 XLOC 对时的细胞活力来评估开发的双 CRISPRi 方案的功能。因此，引入靶向 RP11 和 XLOC 的不同 gRNA 以降低靶 RNA 水平。使用 SadCas9-KRAB-MeCP2 或 SpdCas9-KRAB-MeCP2 的靶标特异性 gRNA 研究 RNA 的抑制，与靶向 Rosa26 的对照 gRNA 一起单独和组合测试（见 图 2B）。尽管靶向 XLOC 或 RP11 的 gRNA 单独有效地抑制了各自的靶标，但只有使用 XLOC-sa/RP11-sp 对才能同时敲低 XLOC 和 RP11。

由于使用选定的 XLOC-sa/RP11-sp gRNA 对在 501-mel 细胞系中成功降低了 XLOC 和 RP11 RNA 水平，因此进行了双重 lncRNA 抑制活力测定（参见 图 2C）。5 天后，当单独使用靶标 gRNAs 时，细胞活力分别为 Rosa26 对照的 81% 和 89%。与单独使用 RP11-sp 相比，将 RP11-sp 和 XLOC-sa 联合使用导致进一步显着降低，细胞活力为 Rosa26 对照的 59%。

图 2：双 lncRNA 抑制系统的功能。 （A） 使用抗 Cas9 抗体进行蛋白质印迹分析以检测修饰的 501-mel 细胞中的 dCas9-KRAB-MeCP2 变体。使用没有转导的 501-mel 野生型 （WT） 细胞作为对照（原始印迹参见补充图 3、补充图 4、补充图 5、补充图 6）。（B） 在将双 gRNA 转导到修饰的 501-mel 细胞中后，相对于 Rosa26 对照细胞的 RP11 和 XLOC RNA 水平的基于 qPCR 的分析。GAPDH 用作看家基因。数据表示为平均值 ± SD。（C） 在以三个独立的转导将双 gRNA 整合到修饰的 501-mel 细胞中后，进行双 lncRNA 抑制活力测定。将发光值归一化为 Rosa26 对照。活力结果表示为 SEM ±平均值 （n = 3）。进行未配对的 t 检验。星号 （*） 表示 p < 0.05 处存在显著差异。 请单击此处查看此图的较大版本。

补充图 1：质粒图谱。 该地图是使用 Benchling （https://benchling.com/） 创建的。方案中使用的质粒是从 Addgene #96921 和 #110824 修改而来的。 请点击此处下载此文件。

补充图 2：补充图 2：Western blot 分析
dCas9-KRAB 表达。 （A） 转染后 6 天，SadCas9-KRAB 在 501-mel 细胞中的表达。（B） 501-mel 细胞中 SadCas9-KRAB 和 SpdCas9-KRAB 的序贯转导导致转染后 3 周 SadCas9-KRAB 表达降低。（C） 在 501-mel 细胞中同时转导 SadCas9-KRAB 和 SpdCas9-KRAB 导致转染后 3 周 SadCas9-KRAB 表达降低。（D） 同时转导 SadCas9-KRAB 和 SpdCas9-KRAB 后可观察到 SpdCas9-KRAB 表达。LV. 使用的慢病毒体积 μL。 请单击此处下载此文件。

补充图 3：Western blot SaCas9-KRAB 原始数据。 请点击此处下载此文件。

补充图 4：Western blot SpCas9-KRAB 原始数据。请点击此处下载此文件。

补充图 5：GAPDH_SpCas9-KRAB 原始数据。请单击此处下载此文件。

补充图 6：GAPDH_SaCas9-KRAB 原始数据。请单击此处下载此文件。

补充表 1：使用的向导 RNA 序列。请点击此处下载此文件。

补充表 2：利用的 DNA 序列。请点击此处下载此文件。

补充文件 1：dual-grna-zeo-gfp 的 FASTA 文件。请点击此处下载此文件。

补充文件 2：dSpCas9-krab-mecp2 的 FASTA 文件。请点击此处下载此文件。

补充文件 3：dSaCas9-krab-mecp2 的 FASTA 文件。请点击此处下载此文件。

在这项研究中，我们使用基于来自两个正交物种的 dCas9-KRAB-MeCP2 的 CRISPRi 在黑色素瘤细胞中实施了双 lncRNA 靶向策略。利用该系统，我们成功抑制了一对合成致死的 lncRNA，RP11 和 XLOC，导致细胞死亡增加，这与它们单独被抑制时不同。然而，CRISPRi 系统存在脱靶基因抑制的风险，可能会影响结果解释。虽然没有进行实验验证，但我们在 计算机模拟 gRNA 设计过程中最大限度地减少了潜在的脱靶效应。

转导效率的可变性可能会影响可重复性。因此，我们通过应用等量的慢病毒来优化转导，通过使用不同慢病毒浓度的标准曲线校准来确定。然而，新设计载体的货物尺寸增加可能会限制慢病毒包装效率，可能会降低转导效率，尤其是在难以转导的细胞系中。因此，在某些情况下，实现足够的转导和稳健的 dCas9 表达可能需要高病毒滴度。此外，通过频繁监测 dCas9-KRAB-MeCP2 蛋白水平和靶向 lncRNA 的 RNA 表达，可以避免敲低不足。或者，也有仅使用一个阻遏蛋白系统的 dCas9 版本来克服这一限制，但代价是效率降低²⁵。

只有 XLOC-sa-RP11-sp 组合表现出成功的活性，而反向 XLOC-sp-RP11-sa 配置无效。对敲低功效差异的一个合理解释是 PAM 特异性和染色质可及性之间的相互作用³³。鉴于 SaCas9 和 SpCas9 识别不同的 PAM 序列，SpCas9 在 XLOC-sp-RP11-sa 方向的靶位点可能缺乏最佳 PAM，从而降低其结合亲和力和后续活性。此外，两种 dCas9 融合蛋白变体的空间排列可能影响染色质结构和可及性^34,35，从而可能限制 XLOC-sp-RP11-sa 构型中转录机制或相关调节因子的募集。这些发现表明，SaCas9 和 SpCas9 在给定基因组环境中的相对定位可能会严重影响它们的功能功效，这一方面值得进一步研究基于 CRISPR 的优化调节策略。

开发的方案适用于通过修饰双 gRNA 载体靶向或筛选其他合成致死非编码 RNA 对。一旦目标细胞系稳定表达两种 dCas9 变体，各种方法就变得可行。虽然 RNAi、ASO 和 shRNA 可用于基因沉默，但 CRISPRi 提供了一种更直接的筛选方法，并且还可以与小化合物或抑制剂结合使用。通过用双 gRNA 文库替换双 gRNA 载体，该方案允许系统筛选癌细胞中的合成致死对或其他遗传依赖性，从而提高癌细胞靶向的精度。

尽管我们通过慢病毒转导实现了 dCas9-KRAB-MeCP2 变体的整合，但也可以使用替代的稳定转染方法将所需的酶掺入 501-mel 细胞中。这尤其相关，因为根据我们的经验，dCas9-KRAB-MeCP2 等大型构建体的沉默可以随着时间的推移而发生^36,37。或者，dCas9-KRAB 被证明是一种较小的替代品²³。根据我们的经验，用源自 Cas9 直系同源物的较小 dCas9-KRAB 融合蛋白转导导致长时间培养期间蛋白质表达降低（参见补充图 2）。因此，应在重复的时间点定期监测一致的蛋白质表达。此外，转导两种大融合蛋白以及选择标记和双 gRNA 表达盒可能会诱导细胞应激或达到慢病毒包装能力。

由于gRNA设计不理想或dCas9表达不足，在双CRISPRi中实现100%的敲低效率可能具有挑战性。为了解决这个问题，应使用先进的设计工具测试每个靶标的多个 gRNA，以确定最有效的序列。此外，通过改进载体设计和克隆细胞系表征来优化 dCas9-KRAB-MeCP2 表达可以提高敲低效率。

整合 CRISPRi 系统的替代策略包括使用转座酶载体或 CRISPR 定向整合，以实现稳定插入安全港基因组位点，众所周知，这些位点在时间内保持稳定表达³⁸。然而，许多细胞类型（包括黑色素瘤细胞）都难以转染³⁹，因此慢病毒转导是首选方法。基于转座酶或 Cas 的酶的电穿孔可能提供一种将 dCas9-KRAB-MeCP2 构建体整合到黑色素瘤细胞中的替代方法⁴⁰。实施诱导型敲除系统有利于根据需要激活 dCas9-KRAB-MeCP2 表达，而不是组成型表达以最大限度地减少细胞应激。

最后，开发的方法不仅限于黑色素瘤细胞，还可以扩展到正在研究合成致死性的任何细胞类型。这种方法明确表示要扩展到 gRNA 文库筛选模式。然而，由于组合复杂性的增加，例如，每个基因对超过 3 个 gRNA，包括对照和至少 300 x 覆盖度，实际上只能靶向表达的 lncRNA 的亚转录组部分。因此，在进行文库筛选之前，用户必须通过考虑 lncRNA 表达水平及其在特定细胞环境中的已知相关性等因素来仔细预选候选基因。然而，这种方法的组合多功能性使其成为研究 lncRNAs 在各种癌症类型和潜在其他疾病中的合成致死相互作用和其他遗传依赖性的宝贵工具。这扩展了目前可用于研究细胞中这些网络相互作用的工具包。

Jochen Imig 目前由辉瑞公司资助。CGCIII 由辉瑞公司、默克公司和阿斯利康公司赞助。申办者在研究的设计、执行、解释或撰写中没有作用。所有作者都没有需要披露的利益冲突。

我们感谢 Stefan Raunser（多特蒙德马克斯普朗克分子生理学研究所）使用生物安全 2 级实验室空间。特别感谢 Eric Wang 的学术贡献，以及 Imig 实验室所有过去和现在的成员，感谢他们进行的宝贵讨论。Jochen Imig 目前在 CGC III 上由辉瑞公司资助。