秀丽隐杆线虫 作为发现生物活性化合物对抗聚谷氨酰胺介导的神经毒性的模型系统

在这里，我们提出了一个方案来评估 秀丽隐杆线虫中测试化合物的神经保护活性，包括聚谷氨酰胺聚集，神经元死亡和化学避免行为，以及多种表型的示例性整合。

与年龄相关的致病蛋白错误折叠和聚集是导致几种神经退行性疾病的原因。例如，亨廷顿舞蹈症（HD）主要由编码亨廷顿蛋白中膨胀的谷氨酰胺束的CAG核苷酸重复序列驱动。因此，抑制聚谷氨酰胺（polyQ）聚集，特别是聚集相关的神经毒性是预防HD和其他多Q相关疾病的有用策略。本文介绍了使用已建立的polyQ转基因 秀丽隐杆线虫模型 评估测试化合物对HD的神经保护能力的广义实验方案。AM141菌株被选择用于polyQ聚集测定，因为由于polyQ::YFP融合蛋白的肌肉特异性表达，可以在成年期在其体壁上轻松观察到离散荧光聚集体的年龄相关表型。相比之下，在ASH神经元中具有强烈表达的polyQ扩增束的HA759模型用于检查神经元死亡和化学避免行为。为了全面评估目标化合物的神经保护能力，最终将上述测试结果以雷达图的形式呈现，以直接比较和直接观察的方式对多种表型进行剖析。

亨廷顿舞蹈症的进行性神经退行性变涉及致病性突变亨廷顿蛋白，其多Q由CAG三核苷酸重复序列^1，2，3编码。具有超过37个谷氨酰胺重复序列的突变亨廷顿蛋白容易在HD患者和动物模型^4，5的大脑中聚集和积累，最终导致神经变性⁶。尽管polyQ聚集体在疾病病理学中的作用缺乏明确性⁵，但抑制polyQ聚集及其相关毒性是HD和其他多Q疾病的有用治疗策略^4，7，8。

由于神经元信号通路的保存和易于构建的转基因疾病模型， 秀丽隐杆线虫 已被广泛用作研究神经系统疾病的主要模式生物^{9，10，11，12}。例如，表达易聚集性polyQ扩增 的转基因秀丽隐杆线虫 模型可以客观地模拟HD样特征，例如选择性神经元细胞丢失，细胞质聚集体形成和行为缺陷¹³。对测试样品在已建立的polyQ线虫模型中逆转这些表型的潜在影响的研究导致鉴定出各种有希望的治疗候选物，例如多糖^7，14，15，寡糖¹⁶，天然小分子^17，18和草药提取物和配方^19，20。

这里描述了两个主要的polyQ C. 秀丽隐杆线虫 模型和潜在应用的相关方案，例如黄芪，一种从黄 芪⁷中分离出来的多糖。对于 秀丽隐杆线虫的 polyQ 聚集测定，使用的模型是转基因菌株 AM141，其显示由于 Q40::YFP 融合蛋白（40 个残基的多Q 束）的表达而在到达成年期时，荧光点分散在其体壁肌肉中，Q40 残基 （polyQ40） 融合到黄色荧光蛋白 （YFP）^21，22.菌株HA759用于检查神经元存活和化学避免行为，因为它在ASH神经元中强烈表达绿色荧光蛋白（GFP）和Htn-Q150（人亨廷顿蛋白衍生的150个残基的polyQ束），但在其他神经元中表达较弱，导致进行性神经变性和ASH细胞死亡^7，13。通过整合不同测定的结果，提供了治疗候选药物的神经保护潜力的全面摘要。

注意:有关该协议中使用的溶液配方，请参见 表1 。

1. 秀 丽隐杆线虫 测定材料的制备

1. 秀丽隐杆线虫菌株的维持
   1. 获得 秀丽隐杆线虫 （AM141和HA759）和 大肠杆菌 （OP50和NA22）菌株（参见 材料表）。
   2. 将接种有 大肠杆菌 OP50的线虫生长培养基（NGM）板上的线虫维持在20°C AM141²¹ 或15°C用于HA759²³。
2. 大肠杆菌OP50细菌培养物的制备
   1. 从卢里亚-贝塔尼（LB）条纹板中挑选一批 大肠杆菌 OP50，并将其接种到50 mL液体LB培养物中。
   2. 将OP50细菌在37°C和200rpm的振荡器中孵育，直到在570nm（OD₅₇₀）处的光密度为〜0.5。
   3. 将OP50细菌培养物储存在4°C，并在两周内使用。
3. 使用OP50细菌制备NGM板
   1. 将20克琼脂，2.5克蛋白胨，3.0克NaCl和975毫升去离子水加入1升可高压灭菌的瓶子中。在121°C高压灭菌30分钟。
   2. 将液体NGM琼脂瓶放在工作台上冷却至〜60°C，然后加入以下无菌储备溶液:1 mL 1 M CaCl₂，1 mL 1 mL 1 mMGSO₄，1 mL 5mg / mL胆固醇和25 mL 1M磷酸钾（pH 6.0）。
   3. 将20 mL NGM倒入无菌的90毫米培养皿中，并将板放在工作台上冷却和凝固。将盘子倒置，让它们在室温下在工作台上干燥2天。
   4. 将200μLOP50细菌培养物分配到每个NGM板上，并用无菌玻璃涂层棒均匀分布。合上盖子并将板在37°C下孵育过夜。
   5. 将接种有OP50的NGM板存放在带有盖子的塑料盒中，并在室温下使用。
4. 年龄同步 秀丽隐杆线虫种群的 制备
   1. 将重力成线虫收集到无菌的1.5mL微量离心管中，并以1000× g 离心1分钟。洗涤三次，并将线虫重悬于M9缓冲液中。
   2. 加入等体积的漂白剂溶液，轻轻搅拌3-5分钟。在解剖显微镜下每15秒监测一次漂白。
      注意:漂白剂溶液必须在使用前通过混合等体积的10%NaOCl和1 M NaOH新鲜制备（表1）²⁰。
   3. 一旦大多数线虫被破坏，通过用M9缓冲液稀释来停止消化。快速离心除去上清液，并将沉淀重悬于M9缓冲液中，重复洗涤三次。
   4. 将沉淀重悬于S培养基中。让线虫残渣通过重力沉降2-3分钟，而卵子保留在上清液中。
   5. 将上清液吸入新的无菌微量离心管中。通过以1000× g 离心1分钟收集卵子。
   6. 弃去约80%的上清液，并将卵子转移到含有20 mL S培养基的无菌烧瓶中。将烧瓶放入摇摇杯中，在没有食物的情况下以120rpm的速度孵育卵过夜，以获得同步的L1线虫。

2. 聚Q聚集测定

1. 用于 polyQ 聚集测定的线虫的制备
   1. 将AM141的300-500个同步L1幼虫转移到48孔板的每个孔中，其中500μL含有OP50（OD₅₇₀ 为0.7-0.8）和5mg / mL黄芪，通常每次处理一个孔，持续一个时间点。
   2. 用石蜡膜密封板，并在20°C和120rpm下孵育24，48，72和96小时。
   3. 在无菌的1.5mL微量离心管中收获线虫，并用M9缓冲液>3次离心（1000× g1 分钟）洗涤以除去剩余的OP50。将AM141线虫重悬于M9缓冲液中，并准备好进行图像采集。
2. 荧光图像采集和数据分析
   注意:使用此高内涵成像系统自动分析数据。如果没有自动成像设备，可以使用常规方法制备琼脂糖垫进行图像采集^，通过使用普通荧光显微镜7，¹⁵，¹⁷来实现类似的性能（参见步骤3.2和3.3）。
   1. 将10-15个线虫转移到384孔板中的每个孔中（最终体积为每孔80μL）。每次处理设置10个重复孔。
   2. 向每个孔中加入10μL200mM叠氮化钠以麻痹线虫并使其沉降到底部（5-10分钟）。
   3. 将板置于高内涵成像系统中以获取荧光图像（有关设备和软件信息，请参见 材料表 ）。
   4. 打开图像采集软件并设置以下参数。
      1. 打开" 板采集设置" 窗口，创建新的实验集和名称。
      2. 选择" 放大倍率 "为 2x，选择 "相机合并 "为 1，选择 "板类型" 为 "384 孔板"。
      3. 设置要访问的井和站点（单个站点）。
      4. 选择荧光素异硫氰酸酯（FITC）滤光片 并启用基于图像的对焦选项。
      5. 将 曝光 设置为 300 毫秒。
         注:可以测试和调整上述设置，以优化成像参数。
      6. 保存 图像采集 设置，然后单击" 采集板 "按钮运行。
   5. 使用图像分析软件分析图像数据。
      1. 打开" 检查板数据 "窗口，然后选择用于图像分析的 "测试印版 "。
      2. 双击测试井以显示其图像。
      3. 选择 "计数核" 作为分析方法，然后单击 "配置设置" 按钮以显示以下设置的窗口。
      4. 定义 FITC 通道中的源图像，然后选择 标准算法。
      5. 按如下方式设置图像分析参数:近似最小宽度= 10μm（= 2像素）;近似最大宽度 = 50 μm （= 12 像素）;高于局部背景的强度 = 1，000-2，000 灰度。
      6. 测试当前设置以优化分析方法。
      7. 保存设置并对所有孔运行分析。
         注意:完成一个384孔板的分析需要约20分钟。
      8. 将 总核 导出为每个孔中Q40::YFP聚集的总数。
   6. 计算每个孔中线虫的数量。
   7. 计算每组中每条线虫 Q40::YFP 聚合的平均数，并对每个时间点的数据应用非线性曲线拟合。
   8. 使用以下等式 （1） 计算抑制指数:
      抑制指数 = （1）
      其中N_个对照 组和N_个样本 分别是对照组和处理组Q40::YFP聚集的平均数。

3. PolyQ 介导的神经毒性检测

1. 用测试样品处理秀丽隐杆线虫
   1. 为了制备用于polyQ神经毒性测定的线虫，将HA759的300-500个同步L1幼虫转移到48孔板的每个孔中，其中500μL S培养基含有OP50（OD₅₇₀ 的0.7-0.8）和5mg / mL黄芪，通常每次处理有三个重复孔。
   2. 用石蜡膜密封板，并在15°C和120rpm下孵育3天²³。
   3. 离心收集线虫，用M9缓冲液洗涤3-5次。将线虫重悬于M9缓冲液中，用于神经元存活和回避测定。
2. 琼脂糖垫的制备
   1. 将2g琼脂糖加入100 mL M9缓冲液（2%，w / v）中，并在微波炉中将琼脂糖溶液加热至接近沸腾。
   2. 将0.5 mL熔化的琼脂糖分配到放置在两块2 mm厚玻璃板之间的1 mm厚显微镜载玻片的中心。用另一张幻灯片垂直覆盖。琼脂糖冷却并凝固后，轻轻取下顶部滑块。
3. ASH神经元存活试验
   1. 在琼脂糖垫上加入一滴20mM叠氮化钠。将15-20个HA759线虫转移到液滴中以固定它们。
   2. 将盖玻片轻轻地放在线虫上。将载玻片保存在装有数码相机的荧光显微镜下。选择40倍物镜和FITC滤光片以检测线虫头部区域的GFP阳性ASH神经元。
   3. 在每组中随机选择50个以上的线虫，以计算在其头部区域具有GFP标记的双侧ASH神经元的线虫数量⁷。使用下面的等式（2）计算ASH神经元的存活率。
      神经元存活率 （%） = （2）
      其中N_存活 率和N_总数 分别是具有GFP阳性ASH神经元的线虫数量和每组中测试线虫的总数。
4. 渗透性避免试验
   1. 将不含食物的NGM板（9厘米）分成正常（N）和陷阱（T）区域，中间有一条8M甘油（~30μL）线。将200mM叠氮化钠（〜20μL）线铺展在距离甘油线约1厘米处，以麻痹穿过甘油屏障进入T区的线虫。
   2. 将~200个线虫转移到每组三个重复板的N区。将1%丁二酮（~2μL）滴入T区（距离板边缘1厘米）以吸引线虫。立即盖上培养皿的盖子，并在23°C下孵育90分钟。
   3. 在显微镜下对N区和T区的线虫数量进行评分。使用等式 （3）²⁰ 计算回避指数。
      回避指数 = （3）
      其中 N 和 T 分别是 N 区和 T 区中的线虫数量。数据以三个重复的标准差（SD）±均值表示，代表>3独立实验。
   4. 执行不成对的双尾 t 检验，以比较来自黄芪组和对照组的数据。

4. 创建雷达图

1. 打开绘图软件，将不同测定的数据导入新工作表。输入 A（X） 列作为径向轴的标题，输入 A（Y） 列作为对照组的数据，输入 B（Y） 列作为治疗组的数据。
2. 选择所需的数据，然后单击" 绘图|专用: 工具栏菜单中的雷达按钮，用于生成雷达图。
3. 双击径向轴，然后根据需要调整每个轴的 "刻度"、"刻度"和 "刻度"标签 。
4. 单击菜单中的 "文件 "，然后选择" 导出图形 "以将图像另存为 *.tiff。
   注:材料 表中 的软件网站提供了有关创建雷达图的详细帮助文档和视频教程。

转基因多Q菌株AM141在其体壁肌肉细胞^7，21中强烈表达Q40::YFP融合蛋白。如图 1A所示，该菌株的离散聚集表型可以通过本文中描述的自动成像和分析方案来识别。AM141线虫Q40::YFP聚集体量从L1期开始48 h后显著增加。然而，这种增加的趋势被黄芪处理抑制（图1B），证明了黄芪对polyQ聚集的保护潜力。通常，72 h或96 h可以方便地用作计数Q40::YFP聚集体的时间点，以评估测试样品的抗聚集效果。在该协议中，AM141线虫的荧光聚集体被自动成像系统捕获，尽管荧光显微镜也可用于此目的⁷。

秀丽隐杆线虫菌株HA759在其感觉ASH神经元中同时表达GFP标志物和Htn-Q150，导致这些神经元的进行性丧失和功能障碍^11，13。将线虫安装在2%琼脂糖垫上以确定ASH神经元的生存能力（图2A），并在显微镜下可视化以检测ASH神经元。线虫头部区域双侧ASH神经元中GFP荧光的丧失表明ASH神经元死亡（图2B）。HA759线虫中ASH神经元的存活率在15°C下孵育3天后^7，20在对照组中的存活率为<40%，表明polyQ介导的神经毒性。因此，这种ASH神经元存活测定可用于直观地评估测试化合物对秀丽隐杆线虫神经元的影响，例如黄芪的神经保护作用，而不是茯苓聚糖（图2C）。

由于行为功能障碍是polyQ疾病的主要临床症状，因此使用大量HA759线虫的化学感觉回避测定（图3A）被设计为一种简化的测试，以检查测试样品对polyQ聚集介导的ASH神经元功能丧失的影响。如图 3B所示，未处理的对照组中HA759线虫的回避指数约为0.5，与之前报道的¹⁴相似。有趣的是，在15°C下用黄芪碱处理3天的线虫中，回避指数增加到>0.6（图3B），表明多糖对行为障碍具有神经保护作用。

为了评估测试化合物的整体神经保护能力，可以整合上述单个测定的数据，并将其呈现为多种表型的雷达图，使其成为适合直接比较和直接查看的polyQ表型的统一特征。如图 4所示，黄芪处理组中三角形的面积大于对照组的面积，表明多糖的抗polyQ作用。

图1:黄芪对聚Q40聚集的影响 （A）在20°C下用或不用黄芪处理96小时后AM141线虫的代表性图像。 使用高内涵成像和分析系统从384孔板获取荧光图像（左面板），并且Q40::YFP聚集体（右面板）由系统自动识别。插图是显示 polyQ 聚合的线虫图像的放大视图。比例尺 = 500 μm. （B） Q40::YFP 聚集体的定量。在20 °C下使用高内涵成像系统监测AM141线虫中Q40::YFP聚集体的数量，每24 h监测4 d。 每个时间点对每组中约100-150个线虫的聚集体进行评分。结果显示为基于每个线虫的平均聚集体数的拟合曲线。缩写: polyQ = 聚谷氨酰胺;YFP = 黄色荧光蛋白;FITC = 异硫氰酸荧光素。 请点击此处查看此图的大图。

图2:黄芪对Htn-Q150介导的ASH神经元死亡的影响（A）琼脂糖载玻片制备的示意图。（B）HA759线虫的代表性显微照片，使用400倍放大镜下ASH神经元存活和死亡。比例尺 = 20 μm。使用荧光显微镜对HA759线虫进行拍照，在15°C下用或不用黄芪从L1处理3天后。（C）黄芪对多Q介导的ASH神经元死亡的保护作用。茯苓聚糖是一种来自波利亚椰子的多糖，被用作对照。数据以三个重复的平均值±SD表示，代表三个以上的独立实验。使用不成对的双尾t检验进行统计分析，以将对照组的数据与黄芪和芫荽聚糖组的数据进行比较。*p < 0.05;ns = 无显著性。简称:GFP =绿色荧光蛋白。请点击此处查看此图的大图。

图3:黄芪对Htn-Q150介导的行为功能障碍的影响。 （A）避难测定板的示意图。（B）回避试验的代表性结果。回避指数定义为N区线虫与板块上线虫总数的比值。结果以三个重复的平均值±SD表示，代表了三个独立的实验。使用不成对的双尾 t检验对回避指数进行统计分析。**第 <页 0.01。 请点击此处查看此图的大图。

图4:黄芪的整体神经保护能力。 来自三种不同测定的数据被导入OriginPro软件以创建雷达图，该雷达图用于分析黄芪对polyQ介导的多种表型的一般影响。 请点击此处查看此图的大图。

表 1.请按此下载此表格。

由于polyQ聚集和蛋白毒性是多Q疾病（如亨廷顿舞蹈症¹³）的重要特征，我们建议使用多种模型和方法来全面评估测试化合物的神经保护能力，包括AM141菌株中的polyQ聚集测定，HA759菌株中的ASH神经元存活测定和HA759菌株中的化学感觉回避测定。这里介绍的方案已被用于评估测试样品对polyQ毒性的神经保护能力，包括对polyQ聚集和相关神经毒性的抑制作用^{7，14，15，16，17，19，20}，证明了它们在HD和其他polyQ疾病的药物发现方面的潜力。

引入了自动成像和分析系统，用于检测和计数 polyQ 聚集体测定中的 polyQ 聚集体。该方法具有高通量和省时的优点，可显著减少费力计数过程中的主观误差。对于整个384孔板，只需<1小时即可完成图像采集和分析。然而，传统的显微成像方法在不使用自动成像装置⁷的情况下也显示出类似的性能。

在每个时间点的典型Q40::YFP聚集测定中，建议每次处理总共100-150个线虫，这可以在每个包含10-15个线虫的重复孔中进行。然而，应该注意的是，L1幼虫可能对某些治疗或更高浓度更敏感。因此，较高剂量的测试化合物可能会抑制其生长，导致由于生长缓慢而导致的假阳性结果，从而延迟polyQ聚集。通常，可以进行食品清除测定以解决这一问题并确保测试化合物²³的适当浓度范围。

用于polyQ神经毒性测定的HA759转基因线虫共同表达OSM-10::GFP和Htn-Q150，从而可以明确地识别双侧ASH感觉神经元。因此，ASH神经元的存活率通过GFP表达的存在与否来评估;通常，对照线虫中约40-75%的ASH神经元死亡^23，24。有趣的是，HA759菌株中的 pqe-1 （聚谷氨酰胺增强子-1）遗传突变体背景（pqe-1;Htn-Q150）加速polyQ介导的毒性，导致大多数ASH神经元在三天内死亡，即使在15°C下也是如此，因此该菌株在15°C下生长用于神经元存活测定，如前所述^23，24。

HA759线虫中ASH神经元的功能丧失可能发生在细胞死亡和蛋白质聚集体¹³的检测之前;因此，渗透性避免行为测定对于评估 polyQ 介导的毒性至关重要。为了最大限度地减少低温下活性较低的HA759线虫对行为实验的潜在影响，将避免测定板在加湿的23°C培养箱中孵育，而不是在15°C下孵育，如使用该菌株的神经元存活测定。此外，据报道，Htn-Q150/OSM-10::GFP转基因线虫对鼻子触摸高度敏感;因此，ASH神经元功能的另一种检测是鼻子触摸测定¹³。

作者声明他们没有竞争的经济利益。

我们感谢黄实验室的前成员，他们帮助开发和改进了本文中使用的协议，特别是张寒锐，肖凌云和燕霞翔。本研究由111工程（资助号B17018）和河北省自然科学基金（资助号H2020207002）资助。