多发性硬化症的莱索莱西汀鼠模型中用于测量骨髓含量的 体内 发射断层扫描成像

该协议的目的是通过多发性硬化症动物模型中的定电子发射断层扫描（PET）成像来监测 体内 骨髓的变化（去位和再骨髓化）。

多发性硬化症 （MS） 是一种神经炎症性疾病，在中枢神经系统中具有扩张的轴突和神经元退化和脱位，导致运动功能障碍、精神残疾和 MS 进展期间的认知障碍。正电子发射断层扫描 （PET） 是一种能够量化体内细胞和分子变化 的 成像技术。

与完好无损的骨髓有亲和力的无线电跟踪器可用于对骨髓含量随时间变化进行 体内 成像。可以检测骨髓含量的增加或减少，这意味着这种成像技术可以检测中枢神经系统的去污和再骨髓化过程。在此协议中，我们演示了如何使用PET成像来检测莱索莱西汀大鼠模型中的骨髓变化，该模型是焦点去污性病变（由立体定向注射引起的）（即多发性硬化症的模型）。 ¹¹C-PIB PET成像在基线进行，在鼠脑右纹状体（4微升）和大肠杆菌（3μL）立体药物注射1%后1周和4周，允许量化焦分解（1周后注射部位）和再骨髓化过程（注射部位在4周）。

Myelin PET 成像是监测骨髓含量 体内 变化的有趣工具，可用于监测脱叶疾病进展和治疗反应。

多发性硬化症 （MS） 是一种神经炎症性疾病，影响中枢神经系统，其特征是炎症、脱毛和轴突损失^1。这种疾病的预后是可变的，即使治疗的进展，它是最常见的原因之一，神经缺陷的年轻人^1。MS的诊断基于磁共振成像（MRI）2、3的临床表现和特征病变可视化的标准。

负电子发射断层扫描 （PET） 可以是体内监测 MS 进展和治疗效果的有用工具。标有碳-11（11 C-PIB）的匹兹堡复合B无线电跟踪器（PIB）被广泛用于量化β淀粉样斑块:然而，在过去的十年中，它已被研究量化骨髓的内容，并显示动态的解密和再美化^4，5，6。

不同的淀粉样PET示踪剂^（11C-PIB， ¹⁸F-弗洛贝塔本^，18F-弗洛尔贝塔皮尔^，18F-氟泰美醇）可用于量化骨髓素，并提供有关疾病进展和治疗反应的重要信息，允许识别脱毛和再髓化过程，而不受神经炎症的干扰，这可能发生与传统的磁共振图像（MRI）7。淀粉样PET成像显示，与非活动性患者相比，活跃MS患者的示踪器吸收量减少，这可以解释为活跃患者的早期白质损伤^。在后续研究中，淀粉样体示踪器吸收率降低也与认知衰退有关，表明这项技术是研究该病病理生理学和临床结果的宝贵工具^。

利索莱西汀（LPC）大鼠模型是多发性硬化症的化学诱导模型，其中注射毒素LPC，诱导巨噬细胞的高反应，导致炎症增加，因此，去甲酸化^10，11。在大约4周内，脱模被迅速逆转，这使得它成为评估啮齿动物的脱模和再授精过程的良好模型。该模型已使用PET成像进行评估，效果良好，与验尸论文¹²相关。

在这里，我们介绍了骨髓PET成像的协议与 ¹¹C-PIB在莱索莱西汀大鼠模型，显示这种成像技术是一个有用的工具 ，在体内 测量骨髓含量。

所有程序均按照国家动物实验控制委员会（巴西CONCEA）的准则进行，并经圣保罗大学医学院动物研究伦理委员会批准（巴西CEUA-FMUSP - 协议编号:25/15）。

注:在此协议中，我们展示了如何诱导多发性硬化症的利索莱西汀大鼠模型，以及如何获取和分析骨髓PET图像。

1. 莱索莱西汀溶液准备

1. 使用锥形塑料管（1.5毫升）在分析尺度上称重利索莱西汀（L-α-蛋黄中叶磷脂酰胆碱）。
2. 将无菌盐水加入管中，使1%的溶液（例如:重1毫克的利索莱西汀，用100μL的盐水溶解），并通过摇动管子（左右摇晃，而不是从上到下转动）来溶解溶解溶解裂解。
3. 在启动动物模型感应之前准备解决方案（不要储存最终的现成解决方案）。

2. 莱索莱西廷大鼠模型 - 立体轴手术

1. 使用体重在220-270克之间的雄性威斯塔大鼠。在所有过程中使用手套和面罩。
2. 使用感应盒将 5% 异氟兰混合在 100% O₂ （1 L/min） 中，诱导麻醉。检查动物是否通过观察运动不运动而麻醉（只应观察呼吸）。
3. 将动物放在加热垫上的立体声电子设备中。将动物的鼻子和耳朵固定在设备上。
   注:如何进行立体定向手术的详细信息可以在JoVE科学教育数据库中找到。 神经科学。 啮齿动物立体轴手术。乔夫，剑桥，马萨诸塞州，2021年。
   1. 监测整个过程的麻醉（包括手术和图像采集）。要调整异氟浓度，观察动物的呼吸速率。快速呼吸需要更高的浓度，缓慢的呼吸速度需要较低的麻醉浓度。
4. 注射镇痛药（酮洛芬 - 5毫克/千克）皮下（稀释药物到1 mL盐水，这将有助于水合动物）。
5. 在动物的眼睛里涂上眼霜以防止脱水。
6. 使用 0.5% 的氯河西丁溶液清洁切口区域。
7. 在切口区域皮下注射100μL盐酸利多卡因2%皮下。
8. 剃掉头骨区域
9. 使用无菌仪器进行此操作。
10. 使用手术刀，在头骨上切入约2厘米的皮肤。
11. 用斗牛犬夹子露出头骨。
12. 使用拭子用1%的过氧化氢清洁头骨区域。
13. 定位并标记布雷格玛（立体定向大鼠大脑地图集可以帮助识别布雷格玛）。
14. 将汉密尔顿注射器（μL神经注射器）放置在胸围。
15. 使用布雷格玛和立体轴图集作为参考，将汉密尔顿注射器定位在以下坐标上:前后部:-0.30毫米，横向:-3.0毫米，心室，直到它触及头骨，并标记头骨，并在纸上注明坐标方向。
16. 在标记的坐标上钻头骨。照顾杜拉母校（损坏杜拉母校会导致大量出血）。
17. 在汉密尔顿注射器中填充 7 μL 的莱索莱西汀溶液（盐水为 1%）。更大的体积可以放置在注射器中，但只需注射 7 μL（从注射器中取出气泡以正确测量音量）。
18. 将汉密尔顿注射器放置在以前的坐标上以启动药物注射（总共 7 μL 放入 3 个不同的心室立体坐标中）。考虑到先前注意到的坐标，将汉密尔顿注射器降低到心室坐标-5.0毫米。
19. 非常缓慢地注射2 μL的利索莱西汀溶液（1微升/10分钟）。等待3分钟。
20. 将针头带到下一个心室立体轴坐标（-4.2毫米），慢慢注射2μL的利索莱西汀溶液（1 μL/10分钟）。等待3分钟。
21. 注入第三个腹腔坐标 -3.0 mm （3 μL 的莱索莱西汀溶液 - 1 μL / 10 分钟）。
22. 等待5分钟，然后从大脑中取出汉密尔顿注射器。
23. 缝合皮肤。
24. 将动物从立体定向装置中取出，让动物苏醒过来。
25. 将动物送回家庭笼子，单独饲养动物并接受监督，检查是否有不适迹象。
26. 注射皮下镇痛剂（酮洛芬 - 5毫克/千克）稀释盐水，在手术后24小时和48小时。

3. PET 收购

1. 在注射器中服用 ¹¹C-PIB 放射性的 7 到 20 MBq（1 mL 是允许在大鼠静脉注射的最大体积）。
2. 使用感应盒将动物麻醉，将 5% 异氟兰混合在 100% O₂ （1 L/min） 中。
3. 将 ¹¹C - PIB （上述项目 4 . 1 中定义的放射性）注入大鼠的静脉或尾静脉（两个管理部位都正常，该决定是个人选择）。我们只建议不要使用逆向轨道注射，因为位置太接近感兴趣的区域（大脑），并可能损害图像质量。
   注:基线时间点的图像采集是在立体定向注射之前进行的，其他2个时间点在手术后1周和4周进行。
4. 将动物从麻醉中取出，让动物苏醒（将动物留在温暖的垫子上，直到它完全清醒）。
5. 把动物送回家里的笼子里。
6. 等待30分钟的下一步。
7. 使用感应盒将 5% 异氟兰混合在 100% O₂ （1 L/min） 中的大鼠麻醉。
8. 打开PET扫描仪软件。
9. 选择 扫描 > 宠物准备。
10. 完整的主要调查员详细信息、研究 ID、系列 ID、动物 ID、动物重量 （g） 和其他说明。选择 下一个。
    注意:在动物体重中使用点（。）小数。
11. 编辑用于扫描的投资回报率区域（通常在 3 到 8 之间）。这是将包含在图像中的区域（床罩数字 3 和 8 之间的区域将出现在最终图像中）。
12. 将麻醉大鼠放在PET扫描仪的标准鼠床上，打开麻醉剂（100%O₂ 中3%的异氟是一个良好的开端，然后根据需要调整麻醉率）。要调整麻醉，请检查扫描仪软件的监控数据，以验证动物呼吸的节奏是否恒定而缓慢。
    注:打开真空泵并结合活性炭过滤器收集异氟气过量（如果泵可用）。
13. 涂抹眼霜保护动物的眼睛。
14. 将动物床推入PET扫描仪内。
15. 完整的活动详细信息、活动校准时间、同位素 （C-11） 和扫描持续时间（20 分钟）。选择 "开始扫描"。
    注: 将显示宠物移动床 消息，动物床将进入设备并停在先前选择的 ROI 位置。收购时间将开始倒计时，每秒的计数数将显示 （CPS）。
16. 在扫描仪软件中，导航到屏幕左侧的 监视器 选项卡，检查呼吸参数 更改阈值 更改 （BPM）。
    注:窗口将弹出，并附有阈值参数（500）。选择 确定。
17. 导航到 0% 功率 ，以更改温度参数，在扫描期间加热动物。窗口将弹出:完成参数（80-100）。选择 确定。
    注意:根据室温条件选择 80% 到 100% 的功率（功率越大，温度就越高）。
18. 导航回 扫描 选项卡。
19. 导航到配置工具（齿轮图标）和完整的 注塑时间，剩余活动，剩余活动校准时间。选择 保存。
    注:窗口会弹出"您确定要修改协议元数据吗？">是
20. 导航回 监视器 选项卡（检查动物的呼吸参数，如有必要，增加或减少异氟浓度 - 通常 3% 在 100% O₂ 就足够了）。
21. 完成PET收购后， 宠物就绪 消息将显示在 扫描 选项卡上，查看 箭头出图标 （配置工具的左侧）以搬出动物床。
22. 将动物从麻醉中取出，在温暖的垫子上醒来。
23. 要重建图像，导航 到 重建 选项卡。
24. 检查屏幕左下角的加号图标，并选择将要重建的研究文件。选择 下一个。
25. 导航到 能量分辨率 工具。窗口会弹出。将能量峰值 （keV） 配置为设备参数（基于每月质量控制）。选择 关闭。
    注:执行每月设备校准时，能量峰值可能每个月都会发生变化。
26. 将所有其他参数保持为默认值（等量值voxel大小:400 mm;迭代次数:30;能量分辨率:30%:仅保存最后一次迭代:取消检查保留二进制数据）。
27. 检查 添加。
    注:窗口将弹出"重建已添加到队列中，并在其他完成后开始"。选择 确定。文件将显示在重建选项卡上的重建列表中，状态将显示为等待或%（进度）或完成。

4. 图像分析

注:使用专用图像分析软件进行图像分析。在当前协议中，演示使用特定的软件程序，但如果不可用，则可以使用其他选项。

1. 打开 PMOD>融合它。
2. 导航到屏幕顶部的匹配选项卡。
3. 打开屏幕右中间的 加载输入 菜单，选择自动定向文件，选择 PET 文件（DICOM、互档或 NifTI），添加到已选中、单击操作、重新定向到标准方向、单击 "加载 "和"关闭"。
4. 验证动物物种在屏幕底部是否正确（RAT）。
5. 选中屏幕右下角的 裁剪 框。
6. 调整PET图像中的黄色框大小，以拍摄整个大脑。
7. 单击屏幕右侧的 刚性 按钮。在确认窗口单击 "是"。
8. 单击屏幕右侧的大脑工具以打开参考地图集。选择 Px 鼠 （W. 希弗） - T2.
9. 从右上角选项卡（选择处理阶段选项卡）中选择 匹配结果 。
10. 单击 数据残留 （右上角菜单^的第4个选项卡）。
11. 使用旋转工具（PET 图像中心的白色图标）将 PET 图像与参考模板对齐。检查 3 架解剖平面的对齐。
12. 保存共同注册文件（屏幕右侧菜单）。
13. 选择输出格式（DICOMor NifTI）、目录和文件前缀。单击 "保存"。
    注:如果将共同注册的输出保存为 NifTi，则标题图像信息将丢失。
14. 单击屏幕底部的 VOI 菜单。
15. 导航到 屏幕底部的模板>地图集 （在VOIs窗口下方）。
16. 从下拉菜单中选择 Px 鼠 （W. 希弗） 。
    注意:如果您只需要分析特定的 VOI，您只能选择感兴趣的大脑区域。如果你想要大脑地图集的所有大脑区域，不需要任何行动。
17. 单击屏幕底部的 "大纲 "。
    注:大脑区域的VOI将出现在VOI窗口中。
18. 手动绘制病变部位和反向脑半球区域的VOI（分别为¹¹个C-PIB低吸收区和反向脑半球）。
19. 单击PET图像区域 ^，11个C-PIB低吸收率。
20. 选择 新的VOI >确定。
    注:将显示电子表格
21. 导航到屏幕中间部分的 球形 图标（VOI 窗口左侧）
    注:将显示电子表格。
22. 选择 VOI名称:病变 并选择 应用。
    注:球体将显示在共同注册的图像中。
23. 对齐病变区域的球体，并调整所有解剖平面的VOI。
24. 单击 "关闭 "（在电子表格的底部）。
25. 选择病变VOI（从VOI列表中）。
26. 导航到 VOI镜像操作 图标（在VOI窗口的右上角），并选择 克隆和镜像左/右。
27. 导航以计算 VOI 列表窗口顶部的 选定 VOI 统计 信息。导航以 选择要计算的统计数据 图标来选择输出数据（VOI 统计图标的右侧）。通常对于骨髓内容检查统计组的VOI，平均，SD，分钟，最大）。
    注:将显示电子表格。默认设置数据单元为kBq/cc。在电子表格 （VOI 统计）的左侧顶部，您可以将数据单元检查为 SUV（标准化吸收值）。如果您在扫描仪软件中正确完成了无线电跟踪器管理和图像采集详细信息，如前所述，SUV 数据将由 PMOD 软件自动计算，如果没有，您可以编辑详细信息。
28. 使用系统定位编号格式导航到复制。
    注:验证是否选择所有统计数据作为输出进行复制（检查屏幕右上角的图标）。将复制的数据取决于选定的数据单元。
29. 将输出数据粘贴在记事本或电子表格中。
    注意:注意数字之间点符号和逗号符号的软件设置。这在语言配置之间可能有所不同。
30. 保存带有研究名称和详细信息的文件。

图 1显示说明性 ¹¹C-PIB PET 图像，随着时间的流转，骨髓会发生变化。在基线扫描中，在骨髓含量中看不到任何差异（即不存在去污）。在 1 周时间点图像中，可以看到白色箭头指示的焦点脱叶病变（在右半球）。图像呈现在3个解剖平面（冠状、轴向和下垂），并有可能识别所有这些平面中的脱髓病变。为期 1 周的图像是注射部位良好分界病变的例证，表示正确的模型感应和图像检测。在 4 周的图像中，不再可见病变，表明已经发生重新髓化，骨髓含量恢复正常（或接近它）。

有代表性的图形显示了 3 个不同时间点中 4 种动物图像的量化。第一张图显示了病变（手动VOI）与反侧比的量化结果，显示在进行利索莱西汀注射时，更聚焦的骨髓变化。第二张图表显示相同的量化，但在纹状体（注射纹状体到反向比），在这种情况下，差异在统计学上并不显著，这可以通过小样本量来解释，因为VOI更大，放射性浓度不仅测量赖索莱西汀的注射位置。

Kruskal Wallis 测试分析了各组之间的差异，随后邓恩进行了多次比较测试，结果以平均± SD 的形式呈现。在病变VOI （H = 7.063:P=0.017），在1周图像中，示踪器吸收率（0.90±0.07）比基线（1.07±0.06）低16%，具有统计意义（p=0.024）。4周图像（1.01±0.06）没有发现显著差异。

在纹状体中，没有发现统计差异（H =1.412:P=0.5393）。图像的吸收比率为基线为1.07±0.07，1周为1.02±0.07，4周为1.01±0.08。

第三个图形（底线，左图）显示反侧纹状体（非注射侧）的量化。在此图中，可以观察到时间点之间没有差异（P=9397），这意味着注射侧的变异是由于骨髓的变化，而不是由于跟踪器的吸收变化随着时间的推移。

最后一张图，在右下角，显示了在模型没有很好地诱导的动物中注射部位（病变VOI）的量化（可能是由于快速溶酶素注射、错误的立体税操作和/或不正确的溶液准备）。在这种情况下，在 1 周时间点中看不到较低的吸收率，这意味着没有发生去授精过程，并且 4 周的低吸收量可能与后期的去授精过程或组织损伤有关，这两种情况都与不良动物模型诱导有关。此图被添加到协议中，以说明当动物诱导效果不好时结果的外观，并强调从头到尾协议每一步的重要性。跟踪器吸收（H = 2.745，P = 0.267）没有差异，1.06±0.05、1.02±0.14 和 0.96 ±0.10 的基线、1 周和 4 周 PET 图像的吸收率。

图 2为结果添加了更多信息， 其中图 2A 详细信息根据 MRI 模板参考和 图 2B 显示豪华快速蓝色染色（有关豪华快速蓝色染色协议的详细信息，请参阅 De Paula Faria 等^13）从注射侧和非注射侧在立体增压后 7 天。

图1:说明性 ¹¹C-PIB PET 图像，显示立体定向注射后 1 周和 4 周的基线图像。 图底部的图形表示在不同时间点的示踪器吸收量（n=4）的量化。前两个图形表示注射侧与病变的逆侧的吸收率，以及诱导良好的模型中的纹状体（即在利索莱西汀注射后出现病变的大鼠）。第三个图形（左下）显示了非注射纹状体（负控制）的量化，最后图（右下图）表示未出现脱毛病变（严重诱导模型）的动物注射部位的 ¹¹个C-PIB吸收量。结果以平均±SD的形式呈现， 请点击这里查看此数字的较大版本。

图2:病变位置详情。A） 注射侧（虚线）和非注射侧（白线）的说明性VOIs在立体定向注射后1周手动绘制的MRI模板（体型表和纹状体区域）。 B） 与未注入的侧面相比，Luxol 快速蓝色染色在注入半球中显示出解密（顶部:40 倍放大倍率，底部:100 倍放大倍度）。请点击这里查看此数字的较大版本。

使用莱索莱西汀模型研究多发性硬化症的最大优点是脱髓（约1周）和再骨髓（约4周）发生¹⁴的快速时间表。这种模型也可以诱导在小鼠^15，但是，诱导大鼠更有利于 体内 PET成像，由于大鼠大脑的大小比小鼠更大。

上岗模式的第一步是极其谨慎。²⁰¹⁴ 年，德保拉·法里亚等人为骨髓PET成像验证了这一模型，结果表明，大脑内利索莱西汀注射的速度对于一个诱导良好的模型至关重要。注射必须非常缓慢地进行，每10分钟1 μL，以避免组织损伤。溶液也应在立体定向注射的同一天准备，最好是在开始手术程序之前。如果该模型将首次用于研究组，我们建议在通过PET成像进行任何骨髓定量之前验证该模型。验证需要包括骨髓染色术的死后组织分析，例如: 图2所示的Luxol快速蓝色组织学，以及用于 体内 分析的不同时间点的骨髓基础蛋白（MPB）免疫化。在结果部分，我们显示了辐射跟踪器吸收的量化，其中病变感应没有很好地成功，因此 ^，11C-PIB PET成像没有检测到这些差异。

要通过此技术量化的病变必须大于 PET 扫描仪分辨率（临床前设备约 1 毫米，临床设备约 5 毫米）。

一旦模型被很好地诱导，成像过程必须精心策划，由于放射性跟踪器标记为碳-11，它具有短的半程20分钟。学前成像实验室人员需要准备所有必要的材料，填充麻醉系统，检查一切是否正常工作，并打印在实验期间完成的表格。PET 扫描仪还应在实验前进行验证，此时必须执行设备中所需的所有质量控制（取决于每个国家/地区），以检查扫描仪是否正常工作。接受注射示踪剂后，还必须在校准剂量校准器中测量活动，以保证正确的注射剂量，以及表格上写上的信息（注射器中的活动，注射前后），以及测量的相应时间。确定将要使用哪块手表，因为正确的时间是PET扫描仪工作站上的时间，在图像的衰变校正中会考虑的时间，因此，在实验期间使用的任何手表都应与扫描仪工作站时间同步。

在动物图像采集过程中，应监测温度和动物呼吸，必要时调整麻醉。温度取决于位置，应根据动物的福祉进行调整。图像采集完成后，在将动物放回笼子之前，将动物放在温暖的垫子上进行恢复非常重要。

图像处理对于使用PET成像从实验中获得可靠结果至关重要。理想情况是，分析仪不了解动物群和/或治疗，并且他/她已经拥有PET图像的经验，使用PET示踪器的方式，以保证PET成像和MRI模板之间的完美注册。我们在此协议中使用了 PMOD 软件，但如果此软件不可用，则可以使用替代图像量化软件，尽管必须注意实现良好的大脑区域定义和量化。对于病变位置的定义，必须格外小心，以确保注射部位位于绘制的病变VOI内（需要了解大鼠脑解剖学）。

重要的是说，骨髓PET成像也可以在其他MS动物模型中进行，显示不可预知的病变，正如我们的小组在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）马莫塞特模型⁵中已经显示的那样。如前所述，病变量化中要考虑的重要参数是PET扫描仪分辨率，这是检测过小病变的局限性。与 MRI 等其他技术相比，PET 成像是一种糟糕的分辨率成像技术，但它是一种高度特定的方式，因此，PET 图像的量化使用解剖模板（如 MRI）来帮助绘制感兴趣的区域，如上述协议所示。

虽然 VOI 的手动绘图依赖于操作员，但它是 LPC 动物模型的最佳选择，因为病变可以在动物之间变化。为了减少量化过程中的偏差，执行镜像 VOI 非常重要，正如协议中所解释的那样，该反射 VOI 将位于同一区域，其大小与注入方相同。在 MRI 模板中绘制 VOI 时，考虑立体轴坐标也很重要，以确保考虑正确的大脑区域。使用骨髓染色作为指南，以确定脱毛区域也有助于在绘图，如解释在德保拉法里亚^12。

没有。

β立方体设备（比利时莫莱库贝斯NV）得到圣保罗研究基金会、FAPESP-巴西（#2018/15167-1）的支持。LES 拥有 FAPESP - 巴西 （#2019/15654-2） 的博士生奖学金。

An erratum was issued for: Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. The citation was updated.

The citation was updated from:

de Paula Faria, D., Cristiano Real, C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).

to:

de Paula Faria, D., Real, C.C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).