使用自然循环小鼠的子宫内膜异位症的合成穆林模型

许多啮齿动物子宫内膜异位症模型受技术复杂性、可重复性和/或免疫功能低下的动物或特殊记者小鼠的需求的限制。我们使用任何实验鼠使用独立可验证的客观评分系统，无需进行卵巢切除术或生存手术，即可提供简化的病变诱导系统。

子宫内膜异位症是骨盆疼痛和不孕症的主要原因。它是由子宫外部位的子宫内膜组织的存在来定义的。子宫内膜异位症新疗法和诊断工具的开发受到限制，部分原因是在研究这种疾病方面面临挑战。除灵长类动物外，很少有哺乳动物月经，也没有一种会出现自发性子宫内膜异位症。啮齿动物模型很受欢迎，但需要人工诱导子宫内膜异位症，许多模型利用免疫功能低下的小鼠或手术诱发的疾病。最近，人们更加关注涉及腹内注射的模型。我们提出了子宫内膜异位症的模糊模型，将现有子宫内膜异位症模型的几个特征整合到一个新的简化系统中，该系统依靠微观量化代替主观分级。在这个模型中，我们执行激素刺激的捐赠小鼠，腹腔注射，系统的腹部调查和组织收获，和组织定量，可以在坏死后的任何时间进行和验证。这种模式需要最少的资源和培训:不需要实验室技术人员在穆林生存手术或确定子宫内膜病变方面的专业知识;可用于免疫功能低下、免疫能力和/或突变小鼠:并可靠地创建与人类子宫内膜疾病在组织学上一致的子宫内膜病变。

子宫内膜异位症是女性生殖道的一种神秘疾病^，给1、2岁女性带来沉重的经济和健康负担。子宫内膜异位症的病因尚未完全了解，并提出了多种解释，包括宇宙代谢、胚胎穆勒安息、骨髓衍生祖细胞的招募和逆行月经^3。虽然这些拟议机制的多个方面可能涉及，而且没有单一的解释可以解释该疾病的所有形式，但子宫内膜异位症发病机制的主要模式是逆行月经。逆行月经是月经污水通过输卵管进入腹腔:据估计，90%的月经妇女定期接受逆行月经^4，5。鉴于这种常见的月经逆行现象，为什么子宫内膜异位症只在一部分妇女中发展尚不清楚^。为了更好地了解这种疾病的病因，直接的人类研究是不可行的，动物研究是有道理的。

子宫内膜异位症是治疗和研究的挑战。该病的流行率尚不清楚，但估计为10%^1。虽然一些先进的子宫内膜异位症可以通过非侵入性成像准确识别，但只有通过对手术获得的活检标本进行组织病理分析才能得出明确的诊断:在视觉上看起来是病变的病变，实际上可能是纤维化或疤痕从其他原因^6。疾病的严重程度和程度与症状7^无关。

子宫内膜异位症病变由异质细胞类型和群体组成，这些细胞类型和群体在微环境内以复杂的方式相互作用，因此限制了细胞模型^8、9的用处。在体内模型存在，但这些有内在的挑战和局限性10，11，12。灵长类动物模型是理想的，但往往不可行13，14，15。很少有非灵长类哺乳动物月经并^{自发地发展}为子宫内膜异位症。子宫内膜异位症的啮齿动物模型存在，但每个模型都有限制^17。其中许多模型需要生存手术缝合或植入子宫内膜组织到捐赠者接受壁或肠道，增加了技术复杂性，需要麻醉，并混淆免疫因素从手术本身18，19，20。此外，许多模型需要卵巢切除术和雌激素补充:在增加病变产量的同时，这增加了时间、费用和额外的生存手术。腹膜（IP）注射模型不需要麻醉或生存手术，这些模型逻辑上模拟逆行月经比缝合模型^21，22，23更好。然而，由于注射后子宫内膜片段的随机分散，以及因此在病变识别和测量方面更加偏差，大多数 IP 模型在病变位置的变异性更大。

在这里，我们提出了子宫内膜异位症的穆林模型，将现有子宫内膜异位症模型的几个特征整合到一个新颖、简化和高效的系统中，该系统依赖于微观量化来代替主观分级。

注:在这项研究中使用动物得到了克利夫兰诊所勒纳研究所的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。所有公开的动物护理和使用标准都是根据国家卫生研究院的指导方针执行的。此过程采用无菌技术。佩特里菜是无菌的。使用的PBS/盐水是无菌的。用于尸检和组织解剖的手术器械通过高压灭菌器进行灭菌。我们在动物病例之间的仪器上使用 70% 的 EtOH（如果每节会话超过一次），以减少污染。

1.准备捐赠者和受体小鼠（见图1）

1. 确保获得适当的批准，以便与实验室动物合作。
2. 确定鼠标的应变。在这些实验中，利用了具有C57BL/6J背景的野生型和突变小鼠，但使用类似模型的研究人员报告了与其他小鼠株（如BALB/c小鼠^10）的成功。此外，捐赠者和/或受体小鼠可以使用记者系统，如GFP或RFP小鼠（见图2和图3）。
3. 对于子宫内膜组织移植的时间，确保供体小鼠在注射戈纳多特罗平时年龄在22-24天之间。这确保了他们在生殖上天真，例如，还没有开始可怕的骑自行车。
4. 确保受体小鼠在2至4个月大之间生殖完整（无前卵巢切除术）。虽然不需要，但建议定期将男性小鼠笼子里的尿液浸泡床上用品放在接受者的笼子里，以方便持续的腹膜循环，并在子宫内膜组织移植前72小时再次放置。
   注:这不能确保接受者尿浸的床上用品的放置高度取决于男性床上用品的使用量，并且结果参差不齐。如果需要异质周期的同步，连续三次100 ng/100 μL雌二醇的皮下注射将使所有动物进入最恶劣的阶段。虽然我们发现基于卵清循环相的病变诱导没有差异，但其他组发现周期阶段很重要^。
5. 皮下注射怀孕母马血清果纳多特罗平（PMSG，2 IU稀释成200μL）到捐赠小鼠皮下使用细针（25-27G推荐）。不要给受体小鼠PMSG，因为它会触发排卵和随后的高黄体酮环境，这是不太接受子宫内膜异位症的形成。
   注:先前的小鼠模型已经利用PMSG或雌激素刺激子宫内膜增殖在捐赠小鼠子宫内膜收获²³之前。PMSG 的建议原因如下:PMSG 的半衰岁为 40 小时，而 17-β-雌二醇的半衰岁仅为 2 小时。在采购子宫内膜组织之前，在捐赠者中采用单次皮下注射PMSG，可持续持续接触腺激素刺激，从而刺激内源性雌激素。外源性雌激素的许多制剂需要多次注射才能充分给子宫内膜调高。
6. PMSG 注射后，安排尸检、采购和移植到接受者 38-42 小时之间。在注射后，子宫内膜组织收获的时间，以确保排卵前收集组织，排卵后发生于42小时。排卵产生高黄体酮 （P4） 环境， 这将减少病变的建立.

2. 采购供体小鼠子宫内膜组织

1. 捐赠小鼠安乐死后（使用_CO2室后颈椎错位），用70%乙醇溶液喷洒腹部:这有助于减少从皮肤植物和脱落的头发采购的组织污染。用解剖剪刀，在中线通过皮肤和皮下组织进行浅横向剪裁。然后抓住皮肤切口的每一侧，用钝牵引力打开腹部。
2. 识别子宫。切除子宫之前，修剪掉相邻的结缔组织。将每个子宫角切开，就在各自的输卵管下方，然后转入子宫颈，切除整个子宫群。
3. 从腹腔切除后，仔细检查子宫，并去除任何额外的外周脂肪或结缔组织。将子宫放在一滴冷的PBS上，放在培养皿上。确定并记录整个子宫的组合质量。
4. 从子宫内切除每个角，使转角尽可能接近子宫，从而最大限度地延长每个角的长度。使用解剖显微镜的辅助，将解剖剪刀的一刀片放在第一角的流明内，然后沿着管子的主要轴线切割。小心地打开管子，记住哪一边是血清，哪一边是上皮。
5. 将 500 cc 的盐水或 PBS 放在新的培养皿上;液体会由于表面张力而保持在一起。
6. 然后，以统一的方式进行子宫分裂。与许多较小的病变相比，更大的病变要少。首先，通过抓住子宫内膜层并剥去其去皮，将上皮从肌膜中分离出来。
   1. 或者，只需在不分离肌膜的情况下分割组织（只要上皮侧完全暴露），但保留肌膜会降低该模型与人类疾病的生理相关性。确保碎片尽可能大，但足够小，足以通过18G针;（建议为 1 mm x 1 mm）。
   2. 从第一角收集这些 1 mm x 1 mm 片段中的 10-12 个（大致相当于 C57BL/6J 小鼠的 40 毫克组织）。将收集的碎片放入液体收集中。
7. 执行相同的步骤为另一个子宫角共约24个片段每只小鼠。记录碎片总数。

3. 将组织片段腹膜注射到受体小鼠体内

1. 使用 1 cc 注射器的钝端吸气悬挂的 1 mm x 1 mm 碎片;总容积应为 1 mL。
2. 将 18 G 针头连接到整个注射器上，并将液体加载到针中。考虑模拟注射回培养皿，以确保所有的组织将通过针。
3. 取收件鼠标。在IP注射之前或之后，获得接受者小鼠的阴道涂片，以获得阴道循环文档（10 μL盐水使用阴道孔的灯泡注射器，并用盖唇镀在玻璃滑梯上）。
4. 用注射器以45度角对片段进行腹内注射，注意不要皮下注射。
5. 如果注射后碎片仍然存在，请将额外的 200 μL 液体抽入注射器，以确保所有片段均在腹中成功注射。
6. 一旦保证没有出血或并发症，将受体小鼠放回笼子里，并喂养正常饮食。

4. 子宫内膜病变的收获

1. 移植后约21天对受体小鼠实施安乐死。
   注:根据经验和使用类似模型的合作者的讨论，最大病变大小和数量发生在移植后约3周:3周后，病变开始缩小。使用国际自然保护联盟批准的安乐死方法。
2. 安乐死和颈椎错位后，用70%的乙醇喷洒动物腹部，用解剖剪刀将皮肤切成表面。用剪刀将皮肤和皮下空间切开，直截了当地打开腹部。
3. 在进行进一步解剖之前，对毛病变进行全面调查，用卡钳测量大小，并记录其解剖区域（见下文）。
4. 完整收集三个不同的解剖区域（无论病变是否可被严重欣赏）。如果病变在其他区域（如肠道）看到，这些病变应被忽略，除非病变穿过下面的三个区域之一，否则不应收集这些病变。
   1. A = 腹壁/腹膜（只要样品之间一致，都可以被扁平成盒式磁带或卷起）。
   2. B = 胰腺和中性脂肪。
   3. C = 副宫结缔组织和脂肪（围绕子宫的白色闪闪发光的组织，但不涉及膀胱以外的任何器官;注意不要将膀胱误认为是病变）。
5. 将每个解剖区域放在盒式磁带中，并适当标记，并根据组织切除的实验室协议将其放入正式和处理中。
6. 在两个均匀的深度下，每个组织区域在两个幻灯片（D1 和 D2）中分块正式块。

5. 子宫内膜病变评分

1. 扫描（放大 40 倍）和存档幻灯片。
2. 使用数字幻灯片阅读软件，定义子宫内膜病变边缘之间的最长距离 （X） - 无论边缘由腺体还是频闪组成，并标记它。连续病变由被频闪包围的腺体定义:该线不一定只穿过子宫内膜组织（如确定子宫内膜异位症不规则形状或起伏焦点的终点），但两个终点需要通过连续频闪和/或腺体连接（见图4）。
3. 使第二行 （Y） 跨越第一行 90 度，第二行的长度按照上述规则确定。
4. 如果遇到多个非连续病变，则给每个病变自己的 X 和 Y 测量。
5. 将每张幻灯片的最终分数计算为每个病变区域 （X*Y） 的汇总。
6. 将两张幻灯片（D1 vs D2）中较大的分数作为该区域（A、B、C）的最终分数。
7. 将每个区域的分数总计为该动物提供最终的微观分数。

为了概念实验的初步证明，从RFP小鼠的供体子宫内膜被注射到野生型受体小鼠。H&E染色揭示了子宫内膜异位症病变经典结构的组织病理学确认（图3A）。荧光显微镜证实，观察到的病变来自供体（图3B）。

第二个实验使用10个野生类型C57BL/6J捐赠者和10个接受者进行。另有5名接受者接受了虚假治疗（注射了PBS，而不是子宫内膜片段），并分配了随机识别号码:在坏死和组织病理学复查之前， 审阅者被蒙蔽了双眼。

所有受助人接受PSMG供体治疗后42小时内的供体子宫内膜组织。此时间间隔与最终子宫重量或病变大小之间没有相关性。在捐助者采购时，子宫平均总重量为54±9.5毫克。平均碎片数为22.4±5.2，平均碎片重量为2.5±0.5毫克。所有接受者均在 20 日或 22 日的任何一天进行终点手术。

这些终点的平均病变数为1.5，平均总病变直径为3.7毫米，与其他利用注射子宫内膜片段重量相似的老鼠模型的研究相似（图2）10。所有小鼠的病变患病率为80%。与有病变的小鼠相比，没有病变的小鼠的子宫内膜分馏显著增加（总片段数为30.5个，而小鼠为20.3个;所有小鼠的平均总片段为22.4个），导致注射时碎片大小低于平均片段大小（1.9毫克对2.6毫克）。不出所料，假控制（注射盐水，而不是子宫内膜片段）没有严重或微观疾病。在随后的研究中，使用数量增加的小鼠，受体小鼠的卵点阶段与病变数或微小疾病评分无关。

毛病变数似乎是总病变负担的不良代孕标记，因为组织中存在的宏观疾病和微观疾病之间存在不和谐。在 60% （n = 6） 的案例中，宏观评分和微观评分之间达成了一致意见（协议定义为显示存在或不存在，总大小差异在 3 mm 以内）。但是，在 40% （n = 4） 的案例中， 有分歧，有10%（n = 1）的时间宏观疾病不存在，但显微病存在组织学，10%（n = 1）宏观疾病看到，尽管没有子宫内膜异位症的确认组织学（图5），其余20%（n = 2）有一致存在，但没有病变大小的大小。因此，单靠病变的宏观检查不足以量化子宫内膜异位症的负担。

图1:模型概述。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2:病变量化调查区域。 虽然肠道和其他腹腔内的位置可能含有病变，但更具有挑战性的是区分这些病变，对腹部进行详尽的调查将更加耗时，回报也会减少。因此，在子宫内膜异位症形成的三个最常见的区域（腹壁/腹膜（A）、胰腺和间质脂肪（B）和子宫内膜脂肪（C）中，都采用一致、系统的方法来收获完整的组织（无论是否存在严重疾病）。标记是来自三个区域各病变的微观发现具有代表性的图像。40 倍放大。请单击此处查看此图的较大版本。

图3:使用表达红色荧光蛋白的供体小鼠子宫内膜诱导子宫内膜异位症。 （A） 病变的H+E部分。（B） 荧光显微镜与DAPI染色。40 倍放大。请单击此处查看此图的较大版本。

图4:用于测量病变尺寸和量化病变负担的软件的代表图像。 请单击此处查看此图的较大版本。

图5:经组织病理学检查，不是子宫内膜异位症的严重"病变"代表样本。 请单击此处查看此图的较大版本。

我们的研究表明，子宫内膜异位症可以在小鼠中可靠诱导，而无需使用卵巢切除术和/或生存手术，并且通过腹部的标准化调查和组织分析可以识别和量化异位子宫内膜病变。

许多子宫内膜异位症的研究利用手术诱发的子宫内膜异位症，其中供体子宫内膜被缝合到位到肠道，腹壁，或其他腹腔内位置^12，20。这具有标准化移植组织大小和位置的优势。然而，除了生存手术的后勤挑战之外，这可能从手术本身带来混乱的变量，因为子宫内膜异位症是一种炎症性疾病，而且在临床环境中，子宫内膜异位症通常在任何外科手术之前发展。另一方面，腹内注射更准确地模型逆行月经，被认为是导致大多数子宫内膜异位症病变。

卵巢切除术通常在啮齿动物模型中执行，以减少由雌性周期引入的变异性:由于子宫内膜异位症是一种激素依赖性疾病，因此在这些情况下，将施用超生理剂量的雌二醇。这种做法可以说是将小鼠模型的适用性限制在人类疾病上。我们的研究表明，卵巢切除术是没有必要可靠地创建子宫内膜异位症病变，卵巢循环的阶段不会影响建立病变的能力。

其他腹内注射模型的不足是依赖病变大小或负担的主观措施。虽然使用卡钳或其他仪器可以提供客观的测量，但这些测量记录在病变收获时，因此以后无法核实，并可能受到观察者内部变化的约束。在我们的模型中，组织定量可以在坏死后很久进行和验证，这意味着那些进行尸检的人不需要在识别毛病变方面拥有专业知识，并且更容易对所接受的干预视而不见。此外，正如我们的工作所表明的，如果只依靠严重疾病，可能会错过一定比例的疾病:此外，许多疑似病变实际上可能是生理（例如淋巴组织）或纤维化。最后，在每个鼠标中取取整个解剖区域的标准化部分进一步降低变异性。这种每只小鼠获得相同数量的组织的方法可以防止小样本和大样本的过度评分不可避免的强调，特别是因为可能存在显微疾病。

最终，这些改进有助于标准化和简化方法，从而形成一种小鼠模型，可以以高吞吐量的方式研究子宫内膜异位症。此模型是筛选通路和药物靶点的可测方法，我们的实验室目前正在利用该模型进行药物验证研究。当试图确定异常基因表达（或药物治疗）在供体子宫内膜与接受者腹膜环境中的相对重要性时，该模型特别有帮助。它也可以与记者小鼠（如我们所示）和免疫功能低下和淘汰小鼠一起使用。

总之，我们提供了几个重要的创新，为研究子宫内膜异位症提供了高可靠性、可重复性和客观性的木质模型。我们的方法不仅为病变诱导提供了一个简单、简化的流程，而且提供了测量和报告数据的标准化方法，从而推进了该领域的发展。

作者没有利益冲突可以披露。

我们要感谢Reizes实验室的成员在编写手稿期间所做的批判性审查和见解，以及Lerner研究所的成像和组织学核心在数据收集和数据分析方面给予的帮助。这项工作通过克利夫兰诊所的研究计划委员会提供内部赠款资金，并通过生殖调查协会和拜耳获得外部赠款。Reizes实验室的研究也通过维洛萨诺自行车治疗，妇科癌症研究中心，并通过劳拉J.福加蒂赋予子宫癌研究主席资助。克利夫兰诊所拥有图1和图2的版权许可。