基于AFM的力光谱单分子共价附价

探针分子附于原子力显微镜（AFM）悬臂尖端是研究其物理特性的关键技术。这使我们能够通过基于 AFM 的单分子力光谱，确定聚合物的拉伸力、解吸力和长度，具有高可重复性。

原子力显微镜（AFM）基于单分子力光谱是研究单个聚合物和表面相互作用的理想工具。对于真正的单分子实验，探针分子的共价附着至关重要，因为只有这样，才能获得数百个具有相同单个分子的力延伸痕迹。许多痕迹反过来是必要的，以证明单个分子单独被探测。此外，钝化对于防止单个探针分子和 AFM 悬臂尖端之间以及 AFM 悬臂尖端和底层表面之间的意外相互作用至关重要。此处介绍的功能化协议是可靠的，可轻松应用于各种聚合物。在力延伸痕迹中检测到特征单分子事件（即拉伸和高原）。从这些事件中，可以获得拉伸力、脱解力和脱离长度等物理参数。这对在单分子水平上精确研究刺激反应系统尤其重要。作为示范性系统，聚（乙二醇）（PEG）、聚（N-异丙烯酰胺）和聚苯乙烯（PS）从SiO_x（用于PEG和PNiPAM）和疏水性自组装单层表面（PS）在水环境中拉伸和脱盐。

自20世纪80^年代发明以来，原子力显微镜（AFM）已成为自然科学中最重要的成像技术之一，具有亚纳米空间分辨率、亚皮牛顿力分辨率和在各种溶剂和温度条件下测量的可能性^{2、3、4、5、6、7。3,4,5,6,72}

除了成像^{88，9，AFM9}用于执行单分子力光谱（SMFS），深入了解单个聚合物和表面之间的粘合相互作用，单聚合物的物理特性和蛋白质^{77，10，11，12，13，14，15，1610,11,12,13,14,15,16}的展开机制。在常规的 SMFS 实验中，功能化悬臂尖端与表面接触，使 AFM 悬臂尖端的聚合物进入此表面。通过从表面收回 AFM 悬臂尖端，AFM 悬臂的偏转变化将转换为导致力延伸曲线⁴的力。拉伸力、脱脂力和脱脂长度等物理参数可确定为取决于不同参数，如拉力速度、表面停留时间、入表面入缩进深度、温度、溶剂^17、18以及固体基板、聚合物薄膜^17,或支撑脂质双层^{19、20、21、2220,21,22}等不同表面¹⁹。此外^,，聚合物可以探测不同的空间方向，从而研究聚合物^{23、24、25、26,24,25}的摩擦特性。²⁶

被调查的聚合物附价附着在AFM悬臂尖端对于此类研究至关重要。因此，单分子事件与一个和相同的聚合物绑定到AFM悬臂尖端的高产量，防止任何偏差的结果，由于校准的弹簧常数的AFM悬臂^27，28，不同的连接点²⁹或不同的聚合物（与不同的轮廓长度），如在纳米钓鱼实验^27,3030，31，32的情况下。^,31,32此外，与其他聚合物的相互作用以及平均效应可以广泛防止^{18，28。18,}对于聚合物附价到AFM悬臂尖端，可以应用不同类型的化学修饰，其中许多在赫曼森³³书中总结。基于胺和硫醇的链接反应以及咔嗒声化学代表了AFM悬臂尖端功能化34、35、36、37、38、39、40、41、42中最常用的方法。^{34,35,36,37,38,39,40,41,42}Becke等人⁴⁰展示了如何使用1-乙酰-3-（3-二甲基氨基丙基）卡博迪米德（EDC）/NHS化学将蛋白质附在AFM悬臂尖端。然而，上述功能组倾向于交叉链接，从而导致功能^43，44,44的丢失。此外，在溶液⁴³中，carbodiimids表现出快速水解的倾向。马利米德和三醇群通常更稳定，不表现出交联反应。提出的协议是参考文献^35、39,39中给出的先前发布的协议的优化。

在这里，提出了一个可靠的功能化协议，可以很容易地调整到大量的不同聚合物，无论轮廓长度或疏水性等特性。通过实例选择三种不同的聚合物:亲水聚乙烯乙二醇 （PEG） 和聚聚（N-异丙烯酰胺） （PNiPAM） 以及高摩尔质疏水聚苯乙烯 （PS）。为了提供具有适当链接分子的共价结合功能，选择这三种聚合物作为功能端组采用电传性二醇乳酸。链接分子本身通常是一种短的PEG聚合物，有两个活性位点，一端是硅烷组，另一端是雄性酰胺组。前者使AFM悬臂尖端的共价附价，后者与功能化高摩尔质量聚合物的thiol组结合反应。此外，非活性 PEG 链接器分子充当钝化层，以防止探头聚合物与 AFM 悬臂尖端之间以及 AFM 悬臂尖端和底层表面之间不必要的相互作用。

注:有关原理图概述，请参阅图 1。

1. 试剂设置

注:用于此协议的聚合物是:雄性-聚乙烯乙二醇-三氧西烷（硅烷-PEG-mal， 5 kDa），铁醇-聚乙烯乙二醇-硅醇（HS-PEG-SH，35 kDa），铁醇端端聚酰胺（N-异丙烯酰胺）（PNiPAM-SH，637 kDa）和铁醇端端聚苯乙烯（PS-SH，1.3 mDa）。

1. 准备定义良好和高摩尔质量PNiPAM-SH通过原子转移基聚合，然后转换和减少功能端组引入硫醇摩尔，如文献¹⁸所述。有关详细结构，请参阅图 1。
2. 对于化学品的储存，在带氮气的干手套箱系统中准备较小的等号，以避免暴露于大气中的氧气和水分。PEG和PNiPAM是吸湿^45，46,46和PEG，PNiPAM和PS的功能端组已知很容易氧化时，存储在环境条件33，47，48。^33,47,48所有化学品必须储存在-20°C。
3. 使用分析级溶剂或更高等级的溶剂。此外，使用超纯水冲洗 AFM 餐具片和玻璃器皿，因为单分子实验对所有污染非常敏感。

2. 设备设置

注:使用用不锈钢或玻璃制成的钳子和烧杯。使用倒钳进行安全夹持（例如，型号 R3 SA 具有低弹簧常数）。

1. 准备RCA（超纯水、过氧化氢和氨（5:1:1））溶液，以清洁玻璃器皿和钳子。
2. 将容器放入烧杯中，用 RCA 填充容器，直到玻璃器或钳子完全覆盖。
3. 在 80°C 下，从步骤 2.2 加热烧杯 1 小时。
4. 然后用超纯水冲洗容器，直到不再有刺激性气味（至少三次）。
5. 烤箱中的干玻璃器和钳子 （120 °C）。

3. 提示功能化

注:所有步骤都应在烟雾罩中执行，以避免吸入有机蒸汽。此外，还需要手套、实验室外套和眼部保护。每一步都使用硝酸盐或乳胶手套，以避免污染。使用甲苯时，请戴上耐溶剂手套。所有步骤（除非另有说明）均在 RT 处完成。每一步均使用新设备和手套以避免可能的交叉污染。

1. 通过将氧气等离子体应用于 AFM 悬臂芯片 MLCT-Bio-DC，执行表面激活。
   注:进一步功能化步骤的等离子体处理效率随血浆室中的氧气含量而扩展。
   1. 使用刚清洁的钳子将 AFM 悬臂芯片放入等离子室（40 kHz、600 W）。
   2. 使用定制修改的激活程序:疏散（0.1 mbar） – 将氧气淹没到 0.2 mbar（4 分钟）的压力 - 等离子过程（功率:40%，持续时间:2 分钟，过程压力:0.2 mbar）。
   3. 通风室并立即继续步骤 3.2.2，以防止空气中污染物吸附到 AFM 悬臂芯片。
2. 硅化与培化
   注: 计时是步骤之间的关键参数。在等待期间尽可能新鲜地准备解决方案。马利米德群在水介质中受到水解影响，在溶液^33、47,47中容易氧化为二硫化物，从而阻碍AFM尖端功能化反应。
   1. 在耐溶剂塑料或玻璃管中制备甲苯（1.25毫克/mL）中的硅烷-PEG-mal溶液，并将6 mL溶液倒入扁平的培养皿中，每个溶液3 mL。
      注:如果在 SMFS 实验中观察到多个探针聚合物的结合，则将硅烷-PEG-mal 与非功能性硅烷-PEG 混合可以减少锚点的数量。对于具有不同质量（即轮廓长度）的钝化层 PEG 的调整，可以使用²⁷。
   2. 在西兰-PEG-麦芽溶液中步骤3.1.3（每盘最多10片）在60°C³⁵下，立即孵育AFM悬臂芯片3小时。
   3. 将培养皿从烤箱中拿出来，让溶液冷却至少 10 分钟。
   4. 仔细冲洗每个 AFM 悬臂片。通过空气溶剂接口时，减少毛细管力对 AFM 悬臂的影响，例如，在浸入溶液时，稍微倾斜这些芯片。
      1. 对于 PEG 和 PS 聚合物，用托鲁烯冲洗三次。
      2. 对于 PNiPAM 聚合物，用苯冲洗一次，用乙醇冲洗两次。
   5. 选择至少两个 AFM 悬臂芯片作为控制 AFM 悬臂芯片，跳过步骤 3.3 并按如下冲洗，以增加溶剂的极性:
      1. 对于 PEG 和 PS 聚合物，用乙醇冲洗两次，用超纯水冲洗一次。
      2. 对于 PNiPAM 聚合物，用超纯水冲洗两次。
         注:控制 AFM 悬臂芯片已通过除聚合物附件（步骤 3.3）之外的所有功能化步骤。它们有助于证明功能化过程、AFM 悬臂芯片支架系统的清洁度、表面和用于 SMFS 实验的溶剂。
3. 共价聚合物附件
   注:尽管AFM悬臂尖端预计将完全覆盖于雄性酰胺组，但单探针聚合物只有几个结合位点，因为雄性在水中进行水解，导致不活跃的PEG^47。如上文所述，这些非活动 PEG 充当钝化层。
   1. 在 300m L 培养皿中以下聚合物溶液之一中，在步骤 3.2.5 后直接孵育 AFM 悬臂芯片。如果相应的聚合物未正确溶解，请使用 40°C 水浴并搅拌溶液。
      注:由于使用硫醇端端聚合物可能导致二硫化物键的形成，从而阻碍与硅烷-PEG-mal的雄酰胺组的反应，因此建议使用还原剂，特别是如果步骤3.3应用于水溶性聚合物的水缓冲液^33。
      1. 对于 PEG 和 PS 聚合物，在 60 °C 下，在托露烯中使用 1.25 mg/mL 浓度 1 小时。
      2. 对于 PNiPAM 聚合物，在 RT 时使用乙醇中的浓度为 1.25 mg/mL 3 小时。
         注:如果在SMFS实验中观察到多探针聚合物的结合，应降低聚合物的浓度。
   2. 小心冲洗每个 AFM 悬臂片。
      1. 对于 PEG 和 PS 聚合物，用托鲁烯冲洗两次，用乙醇冲洗两次，冷却 10 分钟后用超纯水冲洗一次。
      2. 对于 PNiPAM 聚合物，用乙醇冲洗两次，用超纯水冲洗两次。
   3. 将每个 AFM 悬臂芯片单独存放在一个小 （1 mL） 的培养皿中，在 4°C 下充满超纯水，直到在实验中使用。

4. 表面准备

1. 氧化硅晶圆
   注:此表面用于带 PEG 和 PNiPAM 的 SMFS。
   1. 使用金刚石刀将氧化硅晶圆切成小块。
   2. 将氧化硅片分别放入微离心管中，然后用乙醇填充这些管子。
   3. 将氧化硅碎片声波10分钟。
   4. 用乙醇冲洗氧化硅片两次，并在氮气流下小心干燥。立即使用氧化硅片。
2. 自组装的单层疏水烷烷醇在黄金 （SAM）
   注:此表面用于 SMFS 和 PS。有关 SAM 的更多信息，请参阅文献^39，49。
   1. 使用镀金硅片（A [100]、5 纳米钛、100 纳米金）执行步骤 4.1.1 = 4.1.4。
   2. 在 1 多德坎蒂奥尔溶液 （2 mM） 中孵育表面部分 18 小时。
   3. 用乙醇冲洗新鲜准备的SAM两次。
   4. 含氮流的干式SAM直接使用或储存在乙醇中长达4天，供以后使用。

5. 数据采集

注:此处显示的所有测量均采用超纯水进行，使用 Cypher ES AFM 使用加热和冷却样品阶段进行温度变化。通常，可以使用所有提供液体测量功能的 AFM。

1. 将功能化的 AFM 悬臂芯片插入 AFM。
2. 将制备的表面粘附到适合在液体中测量的样品支架（例如，高分辨率复制化合物 101RF 或 UV 固化粘合剂）。
   注:这些粘接剂高度惰性，耐大量极性溶剂。在使用前，应检查胶粘剂对非极性溶剂（例如托鲁烯或六烷）或高温的耐受性。
3. 将 AFM 悬臂芯片和探头样品浸入液体中，此处为超纯水。
   注:溶剂落:溶剂落点（约100 μL）可沉积在AFM悬臂芯片支架上。用溶剂覆盖 AFM 悬臂芯片可降低毛细管力，否则，当接近通过空气溶剂界面的样品表面时，毛细管会作用于 AFM 悬臂。
4. 如果需要，调整温度，让系统平衡。
   注:温度变化可能导致 AFM 悬臂偏转，因为 AFM 悬臂具有双金属效应，具有铝或金等反射涂层。在不再观察到偏转信号的进一步变化（MLCT-Bio-DC为15分钟）之前，应远离表面（几μm）进行平衡。
5. 随机改变温度，以排除功能老化的任何影响。确保应用的温度不会导致 AFM 悬臂不可逆地弯曲。
   注:任何温度对溶剂特性的影响（如蒸发或粘度变化）都可能妨碍您的实验。在上述示例中，温度变化范围高达 40 K，以 10 K 步骤作为溶剂（例如，从 278 K 到 318 K）。
6. 通过在坚硬表面（如氧化硅）上采用力延伸曲线，接近表面以确定 InvOLS（反向光学杠杆灵敏度）。为此，获取光探测器（V）与压电距离的偏转信号，并使用线性函数确定表示 AFM 悬臂尖端缩进基础表面（排斥机制）的零件的斜率。为了减少错误，取平均值至少五个值以获取最终的 InvOLS 值。有关详细信息，请参阅文献 4^4、39。
   注: InvOLS 只能在坚硬的表面上可靠地确定。在软表面或界面上进行实验时，请确保将硬曲面放置在靠近软表面的位置。然后，InvOLS 校准可以在软表面实验之前或之后完成，而无需拆卸 AFM 设置。
7. 对于弹簧恒定测定，将 AFM 悬臂移到 AFM 悬臂尖端和表面之间既无吸引力，也无排斥性相互作用的高度（几 μm）。然后，记录绘制功率频谱密度 （PSD） 与频率的热噪声频谱。以下步骤通常由商用 AFM 软件中的自动内置功能执行:首先，通过将函数与 PSD（例如简单的谐波振荡器 （SHO） 配合来分析获得的热噪声频谱。配合在第一次和第二次共振之间完成到最小值。其次，PSD 与频率图的拟合部分下的区域是确定表示 AFM 悬臂垂直方向的平均平方位移。最后，用于获得AFM悬臂力常数^{28、50。28,}
   注:应使用适当的频率范围，包括 AFM 悬臂的第一个谐振峰值。为了获得令人满意的信噪比，至少应累积10个PSD，其频率分辨率最高。
8. 开始实验。以网格状方式采用力延伸曲线（例如，面积为 20 x 20 μm²的 10 x 10 点）来记录力贴图，以避免任何局部表面影响（例如杂质、错位）和平均不同的表面面积。
   注:典型参数为 1 μm/s 的拉速度，采样率为 5 kHz，以确保分辨率充足。当拉取速度变化时，应调整采样率。缩回距离应适应测量聚合物的轮廓或脱解长度（约为预期长度的两倍）。
9. 使用并改变对表面的久坐时间，使单个聚合物粘附在表面（通常为 0 ~ 5 s）。
10. 重复实验结束时的 InvOLS 和弹簧常数的确定，以检查系统的一致性和稳定性。
    注:为了聚合物和表面之间的强附着力，可以在实际实验后进行校准，以保持功能化。

6. 数据评估

注: 对于数据评估，使用基于 Igor Pro 的自定义编写的软件执行以下步骤。

1. 通过使用录制的 InvOLS 和确定的弹簧常数乘法将原始偏转信号（以伏特为单位）转换为力值（以牛顿为单位）。
2. 从压电元素在垂直方向驱动的距离中减去 AFM 悬臂的偏转（在原始偏转信号与 InvOLS 乘法后），以获得真正的延伸（尖端表面距离）⁴。
3. 通过在上次事件后将线性函数拟合到基线并从力延伸曲线中减去相同的曲线，校正为漂移获得的力-延伸曲线。拟合部件应代表从表面的充分延伸，在表面，AFM悬臂尖端和基础表面之间既不观察到吸引力或排斥性相互作用。然后，基线设置为零轴。
   注:在高反射表面（如黄金）进行测量时，可能会出现干扰。这些结果来自表面和AFM悬臂背面的激光束的部分反射。因此，获得的力延伸曲线可能会沿垂直延伸显示正弦力信号伪影。这是阻碍最终力值的伪影。为了继续考虑这些力延伸曲线，可以进行修正（图2）。
4. 如果干扰出现在力延伸曲线中，请选择一个有代表性的力延伸曲线（回缩曲线），显示除非特定附着力和相同正弦伪影（即振幅和相位）（图2A）之外没有其他事件。
   注:平滑代表力延伸曲线，以获得干扰的低频模式。
5. 选择要校正的力延伸曲线（图 2B）。
6. 从步骤 6.4 叠加两个力延伸曲线。和6.5。以确保两者都显示相同的正弦伪影（即振幅和相位）（图2C）。
7. 从力-延伸曲线中减去（平滑）表示力延伸曲线，以校正该曲线，导致直线而不是正弦基线（图 2D）。
   注: 注意代表曲线的未特异性附着力峰与要校正的曲线中出现的任何单个分子事件不同。事实上，选择有代表性曲线对于正确校正至关重要。

以下示例显示了聚合物 PEG、PNiPAM 和 PS 的单分子拉伸和脱脱的结果。所有 AFM 悬臂提示均按照上述协议进行了功能化。PEG 和 PNiPAM 在 SiO_x上测量，温度变化。有关 PEG 和 PNiPAM 由此产生的与温度相关的拉伸曲线的详细讨论，请参阅 Kolberg^,等人¹⁸不同的力延伸图案是恒定力的高原（例如，当从水中的黄金^{4、27、39、5127}中甲基端端烷醇 （SAM） 的自组装单⁴层脱氧器中解出 PS 时）。^39,51

示例 1:水中 PEG 和 PNiPAM 的拉伸
水中与温度相关的拉伸行为是使用单 PNiPAM 和 PEG 聚合物在一端与 AFM 悬臂尖端并另一端的 SiO_x表面物理床共价地测量的。校准和清洁控制实验（不到 2% 的力延伸曲线显示单个分子事件）后，为每个 AFM 悬臂至少记录了两个力图。通过在每个温度下记录至少一个力图来执行与温度相关的实验。当只出现少数拉伸事件时，相应的 AFM 悬臂被丢弃，并取取芯片的下一个 AFM 悬臂（通常按 MLCT-Bio-DC 的 C、B、D 和 E 顺序）。对于 PEG 的模范数据，在 500 个测量的力延伸曲线（19%）中，95 个拉伸事件被观察到。对于 PNiPAM，600 个力延伸曲线中 252 条显示拉伸模式 （42%）。为了更好地比较力延伸曲线，生成了每个温度的单一主曲线。为此，^{只选择拉伸}事件至少为500 pN的曲线，其中构象波动和溶剂效应可以忽略不计。最后考虑的伸展次数是3在278K，7在298K和4在318K为PEG和4在278K，3在298K和3在318KPNiPAM^18。

生成主曲线的过程如图3所示。所选的力延伸曲线（图 3A）被重新缩放为长度为 L_0（以 500 pN 的力进行扩展），参见图 3B。附着力峰显示表面和AFM悬臂尖端之间未特异性粘附的很大变化，但不影响聚合物拉伸行为。合并重新缩放的力延伸曲线后，它们由图 3C所示的双标平滑求平均值。为此，高斯滤波器在等于平滑参数20⁵³的水平上，将来自Pascal三角形的规范化系数的数据卷在一起。最后，如图3D中给出的每个温度，都获得了主曲线。放大显示温度对力扩展行为的影响最显著的范围。

PEG （A） 和 PNiPAM （B） 的温度行为的比较可以在图 4中找到。对于PEG，随着温度的升高，拉伸力的减少。当温度从278度提高到318K时，在100 pN时，在100 pN处重新缩放的扩展增加约5%。对于 PNiPAM，可以揭示一个相反的温度相关变化。当温度从278度升高到328K时，在100 pN处观察到100 pN下重新缩放的延伸量减少约1%。此外，通过确定曲线下的任何给定力值的面积，可以从力延伸主曲线中获得拉伸自由能。这可用于提取能量和各热带贡献的拉伸自由能量的帮助下，分子动力学（MD）模拟^18。

示例 2:水中 SAM 表面的 PS 脱吸
PS从水中的SAM表面的解脱可用于确定脱盐力和长度，从而量化疏水性相互作用。校准后，在表面的两个不同点至少记录了两个力图。当聚合物附着成功时，力延伸曲线显示恒力的高原，作为特征特征，参见图5A和图5C。当探针键的动力学比 AFM 悬臂尖端（准平衡）的拉取速率快得多时，观察到高原状脱盐。高原式力延伸曲线的去附力通过集成力延伸轨迹^54，直接提供附着力自由能量。它们用于测定液体环境中表面单聚合物的静电、分散和疏水性相互作用以及摩擦特性^2,42、4、23、51、54、55。^,23,51,54,55

恒定力的每个高原都装有一个sigmoidal曲线，以确定脱毛力和脱毛长度，然后绘制成方图。直方图装有高斯，以提取最大值和标准差。为了更好的概览，解吸力和长度值在散点图中一起显示，如图5B和图 5D所示。

对于水中SAM上的聚苯乙烯，确定的脱盐力对应于先前获得的值^19、23,23。由于脱盐长度与聚合物轮廓长度⁵¹相关，因此脱盐长度分布可作为相关聚合物通过功能端部组与AFM悬臂尖端共价结合的证明。因此，脱盐长度用作指纹。

对于连接到 AFM 悬臂尖端的多个聚合物，可以在力延伸曲线⁵⁶中观察到高原级联（离散步数）。每个高原代表聚合物在不同延伸处的解渗。图5C和图5D的实验显示了同时连接到AFM悬臂尖端的两种聚合物的典型案例。通过拟合最终破裂，可以发现脱模长度的双模态分布，而脱模力则显示出狭窄的分布。在这种情况下，较小的解波长度可以在90%的力延伸曲线中找到，无论是作为单个高原，还是作为较长高原上的附加高原，如图5C所示。在获得的力延伸曲线的37%中，发现较高的脱盐长度。因此，脱盐长度分布可用于确定连接到 AFM 悬臂尖端的不同聚合物的数量。一般来说，脱盐长度值的窄分布很好地表明，在获得的力延伸曲线中探测了一个聚合物和同一聚合物。同时，可以使用相应力延伸的叠加来确定是否测量了单个聚合物。

在证明单个PS聚合物的共价结合后，可以进行不同的基材（固体表面以及聚合物薄膜）、溶剂条件、温度、拉力速度或居住时间。

图 1:提示功能化过程的原理图概述。包括 AFM 悬臂尖端的化学改性（1） 血浆活化 （2） 硅化/PEGygy 和 （3） 聚合物附件。此外，还展示了所用聚合物的详细化学结构，即PEG、PNiPAM和PS。请点击此处查看此图形的较大版本。

图 2:消除力延伸曲线中的干扰。（A） 查找一个力延伸曲线，显示沿延伸的正弦力信号伪影，但没有单个分子拉伸事件。（B） 选择具有单个分子事件的力延伸曲线，该曲线将从正弦伪影中校正。（C） 叠加曲线以控制曲线的正弦伪影是否真正匹配。（D） 通过从 （B） 中减去力延伸曲线 （A） 获得具有直线基线的力延伸曲线。尽管粘附峰不能用于进一步分析，但力延伸曲线现在针对伪影进行了校正，从而在单个分子事件区域获得更准确的力值（此处: > 0.2 μm 的扩展）。请点击此处查看此图形的较大版本。

图 3:在 298 K 时从 PEG 的力延伸曲线确定主曲线。（A） 实验数据在 298 K，使用 7 力延伸曲线。在 500 pN（B）的力下重新缩放至长度 L₀后，力延伸曲线可以通过双标平滑来合并并求平均值，从而获得主曲线（C）。重新缩放的曲线作为点给出，而主曲线显示为实线。最后，可以比较不同温度的所得主曲线（D）。放大表示温度对力扩展行为的影响最明显的范围。请点击此处查看此图形的较大版本。

图4:PNiPAM和PEG与温度相关的主曲线的比较。对于PEG，当温度升高（A）时，在100 pN（中力范围）处观察到重新缩放的扩展增加，而对于PNiPAM，则显示相反的温度相关偏移（B）。请点击此处查看此图形的较大版本。

图5:分析水中SAM上PS的力延伸曲线。（A） 具有高原（紫色）的西格莫达尔拟合的模范力延伸曲线（蓝色）。此外，箭头标记高原的确定力（红色）和长度（绿色）。sigmoidal 拟合获得的解吸力和脱毛长度值显示在散点图中，生成的直方图装有高斯。（B） 确定的平均脱盐力和脱盐长度值为 （112 × 6） pN 和 （659 × 7） nm，其中 93% 的力延伸曲线显示此类单高原事件。（C） 同时连接到 AFM 悬臂尖端的两种聚合物的模范力延伸曲线（蓝色）。在这里，脱毛力显示平均力值为 （117 × 5） pN 的单模态分布，而可找到双模态分布，用于解吸长度，从而平均长度值为 （656 × 9） nm 和 （1050 × 16） nm。（D） 90% 的采样力延伸曲线仅显示单个高原事件。请点击此处查看此图形的较大版本。

基于AFM的SMFS是研究聚合物物理学中单分子相互作用的主要工具之一。对于真正的单分子实验，探针聚合物附价附着在AFM悬臂尖端是必不可少的。

许多以前的工作是基于纳米钓鱼实验，特别是PNiPAM，其中聚合物被吸附到表面，然后通过随机采摘他们从基质使用AFM悬臂尖端^{30，31。30,}这可能会改变结果，导致对单分子行为的误解。在那里，合作效应可能主导结果，因为不能排除与相邻聚合物的相互作用。这对结果有很大的影响，尤其是对于与单一分离分子^57、58,58相比，在体积上表现出明显不同行为的聚合物。

此处介绍的功能化协议是可靠的，可轻松应用于不同的聚合物，无论其轮廓长度、疏水性或单体的分层障碍。此外，还提供钝化，以防止单个探头聚合物和 AFM 悬臂尖端之间以及 AFM 悬臂尖端和基础表面之间不必要的相互作用。此外，还显示了显示拉伸事件的力延伸曲线的评估。提出了确定主力延伸曲线的程序。这提供了一种更好的方法来揭示，例如，温度相关的影响，以力扩展行为。此外，还给出了具有恒力高原的单分子脱盐事件分析。此外，还给出了一种在力延伸曲线中校正正弦力信号伪影的简单方法，否则可能会损害实验结果。

与Stetter等人³⁹相比，此处介绍的功能化程序被简化为三个步骤，而不是四个步骤，并且提高了该程序的鲁棒性。一步进行培化与硅化的主要好处是具有更好的控制反应，提高产量。此外，需要准备的解决方案更少，需要更少的压裂步骤。这减少了准备的努力和时间，并增加了可重复性。此外，移动 AFM 梯化器始终是功能化过程的关键部分。从一个解决方案转移到另一个解决方案总是有影响功能化质量的风险，因为通过空气-水接口传输，或因不当使用钳子而失去 AFM 气管。

为了证明单个聚合物对AFM悬臂尖端的适当共价附着必须满足不同的条件。首先，控制 AFM 梯级非常重要，应针对每个功能化做好准备。如果少量力延伸曲线在控制实验中显示拉伸或高原（在所示示例中小于 2%），则执行实验的功能化过程和流体单元仅被视为清洁。

清晰的拉伸模式，无需进一步滴或最大，对于具有适当的单分子拉伸事件至关重要。此外，应分析断裂力对破裂时力载荷速率或拉伸曲线完全弹性反应的依赖性，以排除多个聚合物^59、60,60同时脱盐。对于 PEG 和 PNiPAM，在表面不同位置拍摄的 19% 和 42% 的力延伸曲线分别表现出这样的拉伸模式。为了获得拉伸事件，聚合物到相应基础表面的物理化必须强。否则，将观察到类似高原的解吸事件。对于在高力（高达 500 pN 或更多）下检测拉伸事件，这更加具有决定性。由于这种强物理作用并非每个力延伸曲线都满足，因此此类事件的产生率低于纯高原式解吸事件。作为替代方案，可以使用聚合物和底层表面之间的强粘附组，如催化剂或化学化。然而，这需要在聚合物^61，62,62引入更多的功能组或耦合位点。

事实上，聚合物的质量（即轮廓长度）提供了宝贵的指纹。虽然质量不能直接转换为测量的轮廓长度，由于以下原因，长度分布是非常有价值的定义单分子事件。对于聚分散度低（± 1.28）的PNiPAM聚合物，我们发现实验中获得的拉伸事件（因此在聚合物长度中）的扩展值存在显著差异。原因之一可能是确定聚合物的长度及其分布。在尺寸排除色谱（SEC）中，目标聚合物的相对重量与PS或聚（甲基甲氧乙酰^）63等标准相比确定。假定的相对重量预计将偏离绝对分子量，因为目标聚合物的水动力半径和标准可能明显不同。此外，在功能化过程中，硅烷层可能被甲苯中的杂水寡头化。这种寡聚物附着在AFM悬臂尖端，导致一个更灵活的层与更少的锚点^64。此外，聚合物与硅层的附着点不一定位于顶点，导致检测到的长度值²⁹的偏移。虽然聚合物模型，如蠕虫链（WLC）或自由连接链（FJC）模型不能在整个扩展范围内正确再现PEG或PNiPAM在整个扩展范围内18，29，41，65，66的各自的力延伸行为，这种聚合物模型可能对其他聚合物和蛋白质系统^{18,29,41,65,661010，15，67，6815,67,68}更有价值。

单个 PS 聚合物（轮廓长度超过 1 μm）的共价附价仅被视为成功，因为大量力延伸曲线显示足够长的恒定力高原（图 5）。通过分离单个聚合物而产生的高原，由一个恒定力的一个急剧下降到基线，如图 5A所示。如果 AFM 悬臂尖端上附加了更多的聚合物，则观察到一级高原^（图 5C）。高原长度（脱附长度），与聚合物轮廓长度⁵¹相关，由于AFM悬臂尖端对基础表面的不特异性附着力（约200nm），必须比任何附着力峰长得多。不应解释仅在单个力延伸曲线中显示的要素。在进行的实验中，100条曲线中至少有80条在表面两个不同点的至少两个力图中显示的高原长超过200nm。此外，使用图 5B和5D中给出的散射图，可分布脱盐长度，可揭示是否和有多少聚合物与 AFM 悬臂尖端结合。就PS而言，从力延伸曲线的高原中吸收的脱盐力和长度的狭窄分布是共价附着成功的证据。这最终证明了功能化协议的成功。因此，我们强烈建议在出版物中展示这种力量和长度分布。

使用包含许多预设参数的内置算法评估力扩展曲线时应小心谨慎。例如，原因是固定采样速率并不适合每个应用的拉取速度，或者力延伸曲线的自动平滑可能平均出重要细节。通常，正确理解相应的评估程序可以防止评估程序中的错误，从而对基于 AFM 的 SMFS 实验的最终结果产生强烈影响。

总之，我们提出了一种功能化协议，该协议可靠，可轻松应用于各种聚合物。此外，给出了对单分子力延伸曲线的正确评价，从而可以确定拉伸力、解化力和脱盐长度等物理参数。提出的协议和程序对于在单分子水平上研究刺激反应系统很有价值。

作者声明他们没有相互竞争的财务利益。

B.N.B. and T.H. acknowledge funding by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Germany's Excellence Strategy – EXC-2193/1 – 390951807, gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder – EXC-2193/1 – 390951807, and grant HU 997/1-13 (project # 420798410).M.G.承认由赫森州高等教育、研究和艺术部在LOEWE项目框架内的部分支持。我们感谢沃尔夫冈·布朗纳博士和弗劳恩霍夫应用固态物理研究所AAF的Agne Zukauskaite博士捐赠高品质的金涂层硅片。