靶向大鼠的小肠:长期输注到肠系膜上动脉

在大鼠的肠系膜上动脉（SMA）中长期输注是一种外科手术，包括SMA近端分支的插管。套管从腹部伤口流出，通过皮下间隙隧道穿回肩胛间褶皱。

肠系膜上动脉可通过股动脉或腋动脉的微创放射导管在人体内进行导管。由于解剖学尺寸小，SMA插管在大鼠中更困难。该研究的目的是描述一种手术技术，用于在大鼠中对SMA进行插管，以在不受限制的动物中将药物长期输注到SMA血管床中，这将导致术后恢复24小时后导管通畅率高。

为了避免 SMA 血栓形成或直接通路出血的风险，分离 SMA 的近端分支，连接远端并用 0.25 mm 聚氨酯毛细管插管，其尖端靠近主动脉 SMA 原点。然后将套管皮下隧道插入动物的颈部后部，并通过人工瓣膜穿过皮肤。套管的外部部分入半刚性支撑系统中，并连接到笼子外的连续输液泵，在那里老鼠可以自由移动。

通过术后血管造影和尸检结果证明了套管的正确定位。在大多数大鼠中，通过泵的总放电和识别用于血液采样或盐水输注的功能性套管，在大多数大鼠中，将盐水输注到SMA区域后，导管通畅。

与大鼠一样，人类的肠系膜上动脉（SMA）起源于腹主动脉，为肠道提供从十二指肠到近端横结肠的动脉血。SMA产生了许多分支。

毛细血管灌注后，肠系膜循环通过门静脉引流到肝脏，在那里经历肝脏代谢，然后重新进入体循环。SMA的插管可用于诊断目的，治疗性栓塞和药物输注，以选择性或连续的方式评估对肠道的影响，或者最重要的是对肝脏代谢和化学清除的影响。在人类中，SMA的微创放射导管插入术用于血管内治疗¹ 或使用几种经皮方法（如经股骨或经腋窝穿刺和插管）进行选择性药物输注² 。

有文献报道了小腹血管插管的不同技术:肠系膜上静脉（SMV）³，肠系膜下动脉（IMA）⁴，肠系膜淋巴管⁵，肝动脉⁶ 或大鼠肠道灌注的离体研究⁷ 。与静脉侧相比，大鼠SMA的插管要求更高，因为同时存在血栓形成和出血的风险，前提是其高压。特别是，当大鼠在手术床上从麻醉中醒来时，如果插管正在操作中，则会出现问题，如果实验需要在手术后在笼子中游离动物，则会出现更多问题。

最近的一篇论文将SMA插管描述为麻醉下动物实验（血压测量）的一部分⁸。然而，没有关于SMA的手术插管用于在不受限制的动物中长期输注的技术。本手稿的目的是逐步描述一种通过近端分支长期插管SMA的手术技术，该技术允许选择性地将药物输注到肠系膜床中至少24小时（及以上）。由于稳定而坚固的插管需要永久结扎并封闭插入导管的血管，因此该技术可避免将导管直接插入^SMA9 ，并通过近端分支的插管接近血管，尽可能靠近主动脉SMA的起源。近端输注允许输注药物到达最宽的解剖床，而不会关闭通过主血管的血流。

大鼠SMA插管技术有许多应用。可以在肠系膜动脉室选择性地施用药物，以获得胃肠道水平的局部作用，并避免全身效应和肝脏药物代谢。SMA罐装大鼠模型比较大的动物模型具有优势:它更便宜，在道德上是可以接受的，并且更容易执行和学习。与小鼠模型相比，SMA插管手术在大鼠模型中也更容易进行。

本手稿中描述的研究得到了当地动物伦理委员会（罗马天主教圣体大学）的批准，并根据意大利卫生部的规定进行。

1.准备插管以插入SMA的近端分支

1. 将外径为0.93毫米，内径为0.5毫米的较大插管切成所需长度（约30厘米）。
2. 将较小的插管（外径0.4毫米，内径0.25毫米）切成约5厘米长，然后将其插入较大的插管1厘米。
3. 用氰基丙烯酸酯胶将两个插管固定在一起，避免腔内堵塞。
4. 将较大套管的游离末端连接到安装在装有生理盐水溶液的 1 mL 注射器上的鲁尔短截杆适配器 （23 G）。
5. 用剪刀削尖较小套管的自由尖端，以利于将导管插入SMA分支。
6. 通过用生理盐水冲洗来检查套管的通畅性。
   注意:套管的尖锐端不会在动物运动期间损坏动脉，因为它将被固定并且不会沿着血管滑动。

2.为外科手术准备大鼠

1. 使用氯胺酮/木拉嗪（100/10 mg/kg）进行肌内麻醉。
   注意:足够的麻醉深度是通过爪捏反射的缺失或接近缺失来判断的。
2. 剃掉手术区域的皮毛:腹部为SMA插管分支，颈部后部为套管出口。
3. 使用手术爪捏反射无菌清洁手术区域。
   注意:所有准备工作均应使用无菌技术进行。
4. 以圆周运动施用磨砂膏或溶液，然后无菌盐水或70%乙醇，3次。
5. 将动物置于仰卧位，使四肢固定。

3. SMA近端分支的插管

1. 通过在切口前测试爪子捏反射来确保适当的麻醉深度。
2. 使用无菌手术，防水悬垂。
3. 用手术刀刀片，在腹膜区域中线处用3厘米的直切口打开腹壁，穿过所有腹部平面进入腹膜。
4. 将用盐水溶液浸泡的纱布放在手术悬垂物顶部的剖腹切口周围。使用缝合线保持手术切口打开。
   注意:所有拭子和手术器械必须是无菌的。
5. 使用棉签识别并暴露小肠。遵循其自然倾向来识别肠系膜。从剖腹切口中取出肠系膜，并将其向下铺在纱布上（图1A）。
6. 通过感受脉动来识别SMA。
7. 使用棉签在肠系膜脂肪之间"让路"，并揭开SMA及其近端分支的2-3个。
8. 选择足够大的SMA近端分支，以允许插管的手术操作。将这个分支（用4-0的丝绸缝合线）绑在距离其原点下游3-4厘米处，以使其膨胀，使缝合线末端足够长，以便以后操纵。
9. 在 SMA 的分支下放置一个刚性支撑。手术镊子的手柄在这里就足够了。
10. 用惯用手用镊子握住较小套管的末端（与另一端较大的套管相连），并用另一只手拉动缝合线末端以拉紧血管并促进导管进入（图1B）。
11. 保持套管尖端与血管平面成20°角，方向与血流相反。
12. 轻轻按压尖端以穿透动脉壁并插入套管。
    注意:在不切割动脉的情况下进行插管;导管的尖端将打破血管壁并便于进入。血液流回插管确认插入正确。
13. 继续将套管插入靠近SMA原点的动脉分支中再插入1cm。
14. 用手术结（4-0丝）将套管固定在动脉上，并通过冲洗1mL无菌盐水溶液或血液采样来验证其正确功能。

4. 套管隧道掘进并放置在输液支持系统中

1. 在改变动物的位置之前，在切口上放置无菌手术悬垂物。
   注意:从背部到腹部的隧道是通过用尖头手术器械在皮下空间施加压力而产生的。应使用无菌手术覆盖腹部和背部切口。
2. 在颈部后部区域做一个1厘米的切口，并容纳一个球形瓣膜。
3. 通过皮下组织将插管从剖腹手术通道传递到放置在颈部的瓣膜（图2A）。用导管塞关闭套管远端肢体，以避免空气流入。
4. 置换腹腔中的小肠。闭合腹壁，用连续3-0的丝线缝合皮肤切口。
5. 用缝线将瓣膜固定在颈部皮肤上。用连续的3-0丝线缝合皮肤切口。

5. 术后管理

1. 给老鼠穿上夹克，以保护按钮阀。在输液过程中用钢棒保护套管的暴露部分，并将其固定在瓣膜上（图2B）。
   注意:由于手术是在无菌技术下进行的，因此不需要使用抗生素。非甾体抗炎药应在术前给药以控制疼痛（5 mg/mL 美洛昔康注射，1 mg/kg，每日一次，最多 3 天）。手术后，将大鼠稳定在代谢笼中输注时间（24小时）。然后用异氟醚吸入重新麻醉大鼠，以达到拆卸输液系统所需的时间。随后，可以将老鼠饲养在正常的笼子中，具有12小时的光/暗循环，并且可以自由获取食物和水。
2. 在输注期间将大鼠稳定在代谢笼中。老鼠现在是醒着的，可以自由地在笼子里移动和进食。
3. 将套管的远端连接到充满50 mL无菌盐水溶液的弹性泵（最大体积为100 mL，流速为5.0 mL / h）。继续输注24小时（图2C）。
4. 在第一天，肌内注射抗生素（恩诺沙星10mg / kg，前24小时），然后通过口服给药（恩诺沙星100mg，在饮用水中500毫升）。在觉醒期间肌肉注射镇痛治疗（酮洛芬5.0mg / kg）和随后几天口服（对乙酰氨基酚200mg在饮用水中）。
   注意:在饮用水中稀释口服治疗以获得可忍受的味道。监测体重测量和水合作用。
5. 在输液时间（24小时）结束时，通过从老鼠身上取下泵，夹套，钢棒和阀门来拆卸动物的外部输液系统。当套管从颈部出来时，将其关闭并切开，在伤口缝合后将该四肢留在颈部皮肤下。
   注意:在此阶段，可能需要通过吸入异氟烷麻醉大鼠几分钟。
6. 将老鼠单独饲养在一个正常的笼子里，有12个小时的光/暗循环，可以自由获取食物和水。
   注意:基线术后食物摄入量约为30克/天 基线水摄入量约为50毫升/天。平均体重应约为400毫克。

在这项研究中，该程序在15只大鼠身上进行。在盐水输注24小时结束时，在代谢笼中没有观察到盐水或失血的迹象，所有动物的腹部伤口和笼子一样干净。

在正常笼子中，观察大鼠5天，每天监测体重和水/食物摄入量。在此期间，粗略检查时动物的一般状况良好，没有行为异常的迹象。所有大鼠在手术后立即再次开始进食。平均每日食物和水摄入量逐渐增加，直到3天后恢复正常，分别如图 3A 和 3B 所示。在 图3C中，可以看到体重增加是有规律的，逐渐增加，直到观察期结束。排便没有改变，每日粪便和尿量正常。

24小时后，只有2个泵中含有盐水残留物（分别为40 mL和20 mL），其中装有50 mL盐水溶液，而所有其他泵（86.7%）都是空的。此外，在此输注期之后，12个插管（80%）仍然具有血液采样和盐水输注功能（5 mL），而3个插管不再专利（其中2个是用残留物连接到泵的插管）（表1）。

在尸检时，100%的插管（n = 15）仍然位于SMA分支中，并且没有大鼠有肠缺血（图4B）或鼓室内出血的迹象。发现3个闭塞的插管分别在距离SMA分支插入0.5 cm，1 cm和1.5 cm处扭结。这种现象可能是由于动物在笼子里的运动。

在5只大鼠中，在手术后立即和泵连接之前，将2mL碘化造影剂注射到肠系膜套管中，通过图像增强器获得血管造影（术中进行血管造影）。在每只大鼠（n = 5）中，有可能看到肠系膜动脉圈和SMA及其主要分支，而没有对比培养基在腹部扩散，如图 4A所示。这证实了套管位置良好并固定在SMA的分支上。

图1:实验照片。 （A）小肠在纱布上的自然性状（可以可视化具有所有分支的SMA）;（B）将套管插入SMA分支的操作员。在容器下方必须有一个坚实的支撑，以保证管子的插入。远端丝绸缝合线闭合血管，近端缝合线将导管固定在分支内。 请点击此处查看此图的放大版本。

图2:输液支持系统。 （A）一旦皮下隧道插入，套管通过白色瓣膜从颈部后部出现;（B）大鼠穿护套以稳定白色瓣膜。输液过程中，钢棒可保护导管。（C）在输注生理盐水期间，用连接到从钢棒流出的套管的弹性泵输注时安置在代谢笼中的大鼠的示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。

图3:观察期5天大鼠食物摄入、饮水量和体重增加（n=15）的代表性数据。 平均每日食物（A）和水（B）摄入量逐渐增加，3天后稳定在生理水平。平均体重增加（C）逐渐增加，直到观察期结束。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 4:（A） 通过套管输注造影剂后肠系膜动脉区域造影（证明插管放置充分）和 （B） 套管在尸检期间仍然位置良好的照片。请单击此处查看此图的放大版本。

表1:输注生理盐水24小时后弹性泵排出和套管通畅。 通过用注射器抽血并在套管中注入5mL盐水来测试通畅性。

这种大鼠SMA输液模型的主要优点是其在绝大多数动物中至少24小时的稳定性和耐用性。输注抗凝血剂可能会延长这个时间间隔。该模型允许在肠系膜区域选择性地可靠地输注药物，靶向小肠和结肠近端部分。

有几个步骤对于该技术的成功至关重要。为了在非常小的容器中实现插管，重要的是选择重量至少为400克的大鼠;性别和年龄无关紧要。选择正确的手术器械和套管类型也很重要。在这里，将较小的聚氨酯套管（0.4 mm外径，0.25 mm内径）插入较大的套管（外径0.93 mm，内径0.5 mm）中，以获得功能性和有用的导管，以允许与小动脉和较大的输液系统连接。

第一个关键手术步骤是从周围脂肪组织中清洁SMA和确定为插管的分支（步骤3.5）。这有助于避免在组织和动脉之间插入套管，这是一个常见的错误。然而，这个清洁步骤很困难，因为SMA的小分支很脆弱，容易损坏。如果分支受伤，可以通过结扎止血并选择不同的近端分支，以免浪费动物。

为了防止插管内形成气泡并避免气体栓塞，套管必须充满盐水，直到尖端才能插入树枝中。为了将套管固定到位，手术线（4-0丝）的应用必须在插入动脉的点和套管尖端之间，直接在导管周围的血管顶部。手术结必须足够紧以固定套管，但不能太紧以阻塞它（步骤3.12）。

确保正确插管的最佳方法是看到血液流回套管（步骤3.10）。在故障排除方面，如果没有发生这种情况，可能是由于以下原因:

插管未正确插入动脉;

插管在动脉内，但被节点以不正确的位置闭塞;

插管在动脉内，套管中的气泡减慢了流量;

套管内形成凝块。

不正确的插入可能是由于插管定位在动脉和脂肪组织之间的空间。在这种情况下，需要重新插入。当容器上方的结遮挡套管时，可以非常小心地解开它并重新制作它。导管中的小气泡通常不会损害插管，也不会危及生命;但是，如果套管中有一个大气泡，则需要使用注射器拉回套管或将导管重新定位在另一个分支中。通常，通过在手术过程中偶尔输注0.2 mL盐水来避免凝块形成并保持套管专利。

这项研究的局限性是对输注时间较长时套管通畅性的评价不足:在这里，当大鼠被安置在代谢笼中时，进行了24小时输注。为了获得更长的输注期，使用抗凝血剂治疗可能是有用的，在本研究中不施用。然而，在输注过程中，大鼠必须被安置在代谢笼中，因为它是唯一支持输注系统的笼子。这个位置对动物来说是不舒服的，如果治疗更长的时间，可能会受到压力。此外，只有盐水溶液用于输注，因此没有关于特定药物施用的结果。该方法的一个局限性是无法输注用于导管的动脉分支（如果存在）。因此，建议将离主动脉最近的分支插管。

文献中没有其他用于无约束动物的大鼠SMA长期输注模型。与多年前描述的IMA插管模型^相比4，这里描述的技术具有更广泛的实验目标，因为它允许在SMA灌注区域输注药物，并且不限于结肠。最近，SMA分支的选择性插管首次用于直接在动脉肠系膜区域输注肉毒杆菌毒素，以研究对肠平滑肌¹⁰的影响，但许多其他药物可以在未来进行测试。例如，可以输注抗凝剂来研究肠系膜血栓形成，或具有肠道微生物群作用^的药物11 ，甚至用于炎症性肠病^的药物12。动脉内输注尤其对肠道代谢研究有用，因为在血液通过肝代谢的门静脉循环之前，药物效果是可评估的。

作者没有什么可透露的。

作者要感谢Cen.Ri.S.罗马圣杯天主教大学（Centro di ricerche sperimentali）获得许可证。