本协议提出了一种评估细胞内一种内在的低活性、单周转蛋白酶的蛋白水解活性的方法。具体来说, 该方法用于评价 PCSK9 的蛋白水解活性, 这是脂代谢的关键驱动力, 其蛋白水解活性是其最终胆固醇功能所必需的。

Proprotein convertase 枯草杆菌9型 (PCSK9) 是一种单周转蛋白酶, 它调节血清低密度脂蛋白 (LDL) 水平, 从而导致心血管疾病。尽管 PCSK9 蛋白水解是其完全胆固醇效果所必需的, 但对其蛋白水解功能的评价是有挑战性的: PCSK9 只知道它自己, 只经历一个单一的营业额, 并在蛋白质水解后, 保留其基底在其活性部位为自动抑制剂。这里提出的方法描述了一种克服这些挑战的试验。该方法的研究重点是细胞间蛋白水解, 并将成功的裂解与分泌的荧光素酶活性联系在一起, 可以很容易地在条件培养基中读出。通过突变、瞬变转染和荧光素酶读数的顺序步骤, 该方法可以在基因或分子摄动条件下, 在高通量的情况下 PCSK9 蛋白质水解。该系统非常适合于临床发现的无义单核苷酸多态性 (SNPs) 的生物化学评价, 以及筛选 PCSK9 蛋白水解物的小分子抑制剂。

PCSK9 靶向 ldl 受体 (ldl R) 降解, 提高 ldl 胆固醇 (ldl C) 和驱动动脉粥样硬化性心脏病^1,2。治疗靶向 PCSK9 稳健低密度脂蛋白 C 和改善心血管结局的患者, 即使添加到积极的降脂治疗与他汀类药物^3,4。然而, 目前批准的疗法仅限于基于抗体的方法, 而且缺乏成本效益^5,6。为了解决这个问题, 不那么昂贵的治疗方案, 一种方法来识别患者可能获得更大的利益, 或两者, 是需要的。

小分子方法可以针对细胞内 PCSK9, 提供一个改进的管理路线, 并降低成本, 使它们成为这个领域的 "圣杯"⁷。然而, PCSK9 已经被小分子所证明是难以用药的。作为蛋白酶, 靶向 PCSK9's 蛋白水解功能是一个很有吸引力的策略, 因为自我分解是 PCSK9 成熟⁸的速率限制步骤, 它对 LDL-R⁹的最大影响是必需的。然而, 到目前为止, 这项战略还没有成功, 可能是由于 PCSK9's 独特的生物化学: PCSK9 仅¹⁰, 执行单翻转反应, 自解裂后, PCSK9 prodomain 仍然绑定在活动站点作为自动抑制剂¹¹, 防止任何进一步的蛋白酶活动的读数。

本文提出了一种评价高通量时尚⁸PCSK9 蛋白水解功能的方法。通过现场定向诱变, 研究者可以利用这一方法来探讨在临床中发现的编码 snp 的影响, 以评估它们对蛋白质水解的影响, PCSK9 成熟的速率限制步骤。此外, 这种方法将有助于设计高通量的屏幕, 以确定 PCSK9 蛋白降解的调制器, 这将最终扰乱 PCSK9 的表现为 LDL R (和调制 PCSK9's 胆固醇效应).最后, 该协议可以适应其他具有本质上低活性的蛋白酶, 只要 i) 一个特定的基质蛋白酶对可以找到, 和 ii) 一个合适的细胞内锚可以建立的基质。

1. 蛋白酶载体的定点诱变

1. 设计和订购自定义合成的寡核苷酸, 通过修改标准站点定向突变协议来安装感兴趣的变异¹²。标准淡化底漆 (没有额外的净化) 是完全可以接受的。
   注: 对底漆设计的一般方法涉及创建部分重叠的底漆, 如表 1所示, 使用的熔融温度 (T_m) 计算器特定的聚合酶的兴趣。
2. 如表 2所示, 在冰上设置聚合酶链反应 (PCRs) 进行现场定向突变。
3. 按表 3所示循环 PCRs。
4. 运行 2-5 µL 的每一个 PCR 在1% 琼脂糖凝胶和可视化的产品, 以确认成功的放大。
   注意: 一个成功的 PCR 将显示一个单一的, 突出的 DNA 波段在大约大小标记的模板 (~ 7.8 kB)。
5. 添加0.5 µL (每 25-µL 反应) 的 DpnI 和孵化样品37°c 1 小时。
6. 将反应的2µL 转化为具有化学 能力的大肠杆菌。
   注: 快速生长的大肠杆菌菌株将减少潜伏期, 但任何克隆菌株都是可以接受的。
7. 将转换盘到含有 50-100 µg/毫升羧苄青霉素的 Luria-Bertani (磅) 琼脂上。在37摄氏度一夜之间孵化盘子。
8. 选择 2-4 个殖民地生长在一个小规模的文化 (2-5 毫升的 LB 培养基与 50-100 µg/毫升羧苄青霉素)。孵化的文化在37°c 在 220 rpm, 直到它是混浊的。
9. 根据制造商的指示, 用质粒 dna 纯化 (即"miniprep") 试剂盒将质粒 dna 从细胞中分离出来。用 microvolume 分光光度法定量测定洗脱 DNA 的浓度。
10. 用一个桑格测序服务 (如核心或商业设施) 广泛地序列质粒 DNA。根据服务规范准备 DNA 样品。在前测序反应中成功使用的底漆如表 4所述。
    注: 由于整个质粒的 PCR 扩增, 建议每个突变体对整个 PCSK9 编码区域进行排序。

2. 高通量荧光素酶的蛋白质水解测定方法

1. 细胞电镀 (0 天)
   1. 使用低通道 HEK293T 细胞进行实验, 并在 Dulbecco 修饰的鹰培养基 (DMEM) 中培养10% 胎牛血清 (血清)。在组织培养罩中进行无菌条件下的所有细胞工作, 直到准备好化验荧光素酶活性。估计试验所需的水井和板材的数量, 预计 transfections 将在每一个条件下进行三个测试。
   2. 将 HEK293T 细胞从母瓶中分离出来, 以最小体积的0.05% 胰蛋白酶-乙二胺-四乙酸 (EDTA) 来覆盖细胞。用2卷 DMEM 补充10% 的血清, 并将细胞转移到无菌管中, 使胰蛋白酶-EDTA 失效。使用自动单元格计数器计数单元格 (并用台盼蓝染色)。离心管在 500 x g 5 分钟恢复细胞。
   3. 吸入含有胰蛋白酶的培养基, 并将培养基中的细胞重组为 2 x 10⁵细胞/毫升的浓度。使用多通道吸管, 将100µL 的细胞转移到白色 (不透明的底部) 96 井板的每个井中, 从而使最终的播种浓度为 2 x 10⁴细胞/井。
      注: 对于最初的实验, 可能还会有帮助, 另外种子一个姐妹, 清底96井板, 以监测细胞生长和遵守在协议期间, 并指导未来的诊断。
   4. 孵育细胞在37°c 和 5% CO₂为 24 h。
   5. 用96井格式准备一盘质粒的主板。将洗脱缓冲液中的每种质粒 (三 HCl、pH 值 8.5) 稀释成96井板的单个井中的50µL。
      1. 为正控制质粒⁸、阴性对照 (S386A) 质粒⁸、无质粒缓冲 (模拟 transfections) 准备4口井。如果计划采用药物或其他细胞治疗方法, 则在每口井中用正控制质粒 (S386A) 和4口井分别制备主板, 每种均为阴性对照 () 质粒和无质粒缓冲液。
2. 转染 (1 天)
   1. 用深井96井板, 用96井板格式制备转染混合物。执行 transfections, 确保准备足够的试剂, 以解释吹打和转移损失。
      注: 以下计算准备足够的试剂来运行一个96井板 (420 井保守估计)。
      1. 将稀释后的脂质转染试剂混合, 将50.4 µL 试剂添加到2050µL 的降血清培养基中。制作一个 DNA precomplexation 试剂的总组合, 将33.6 µL 试剂添加到减少血清培养基的1730µL 中。
      2. 使用多通道吸管, 整除16.8 µL 稀释的 DNA precomplexation 试剂混合物进入深井板块的每一井。
      3. 使用多通道吸管, 整除3.2 µL (160 ng) 的每种质粒从主板进入深井板块的每一井。
      4. 使用多通道吸管, 整除20µL 稀释脂转染试剂混合物的每一个良好的板块, 并混合的内容, 每个井使用多通道吸管。盖上盘子, 让他们坐在室温下 (RT) 10-15 分钟形成脂质: DNA 复合物。
         注: 在转染后, 每井的最终成分将如下:40 的 dna, 0.12 µL 的转染试剂, 0.08 µL 的 dna 预络试剂, 每个井的含量将是10µL 在总容积 (减少血清培养基)。
   2. 用多通道吸管轻轻地在96井板上的293T 细胞上交换培养基, 注意不要扰乱细胞。更换吸气介质与95µL DMEM 补充10% 的血清。
      注意: 这将是一个适当的时间来治疗细胞与任何药物的利益。
   3. 通过多通道吸管将转染混合物的10µL 添加到每个适当的井中。轻轻地旋转盘子, 混合在井中的内容。孵育板材在37°c 与 5% CO₂为 24 h。
      注: 油井的最终容积为105µL, 占24小时的蒸发量。
3. 化验 (2 天)
   1. 准备腔肠素试剂的库存溶液: 3 M 抗坏血酸钠 [溶于磷酸盐缓冲盐水 (PBS), 制备新鲜], 5 米氯化钠, 10 毫克/毫升牛血清白蛋白 (BSA; 在 PBS 中溶解, 准备新鲜) 和2毫米腔肠素 (溶于酸化甲醇, 含200µL 3 氮盐酸每10毫升)。
      注: 2 毫米腔肠素可以储存2周, 当它保持在-80 摄氏度和没有光。
   2. 根据表 5, 为荧光素酶的读数准备2x 腔肠素试剂, 每个细胞和培养基都有一个单独的试剂。混合所有试剂保存腔肠素首先, 过滤混合物通过一个0.22 µm 注射器过滤器, 然后添加腔肠素。保护试剂不受光, 直到它们准备好添加到盘子里。
      注: 由于过滤器失去了溶液, 所以要做足够的试剂来说明过滤器的损耗以及转移的损失。表 5显示了2x 试剂的最终浓度 (以及添加到一个试剂的 96-井板中的库存溶液的数量)。
   3. 在转染后从孵化箱中取出细胞24小时。使用多通道吸管, 把50µL 的条件介质从每个井转移到一个新鲜的, 白色底 (不透明) 的96井板。
      1. 将车牌标记为它们是否包含介质或单元格。如果有超过一个96井板被转染, 标签的板块, 以确保每一个中载板与其母板的细胞。
   4. 使用多通道吸管, 添加50µL 2x 非裂解腔肠素试剂的板只含有条件的培养基。在 5-10 分钟的 RT 中, 轻轻摇动或摇动盘子。
   5. 使用多通道吸管, 添加50µL 的2x 裂解腔肠素试剂的板块包含细胞。在 5-10 分钟的 RT 中, 轻轻摇动或摇动盘子。
   6. 孵化后, 读出平板阅读器中只中板的发光。然后, 阅读同一版阅读器中的含细胞板的发光。
   7. 丢弃车牌并保存文件进行数据分析。

3. 数据分析

1. 使用电子表格软件执行初始数据分析。创建包含单元格和中板结果的电子表格。
2. 手动检查单元格中的数据以识别转染不良的油井。显示 < 5%-10% 的读数的负控制 (S386A) 质粒应该被认为是不良的转染, 使这些数据的解释可疑的水井。
3. 计算模拟转染井各板块的平均背景发光。从该板块的值中减去每个板块的背景。
   注意: 这个值可能是微不足道的, 这取决于使用的板阅读器。
4. 通过计算荧光素酶活性在培养基中的比例, 与各井的总荧光素酶活性相比, 对数据进行处理。由于单元格板包含除细胞外的条件介质, 而中只板含有与细胞板相同数量的条件介质, 因此使用以下方程式是适当的:
   
   在这里, RLU = 相对发光单位, 背景减去读数从板读取器。
5. 计算阳性对照 (S386A) 和负控 (i.) 井的平均分泌荧光素酶。
6. 通过计算 Z 因子¹³来评估实验的整体质量:
   
   注意: 活动值来自正控制 (小波), 非活动值来自负控制 (S386A) 井。接近1的值表明实验质量较高。如果值低于 0, 请考虑重复该实验或优化工作流。
7. 将数据从电子表格程序传输到科学数据分析软件中。
8. 将分泌的荧光素酶活性规范化为阳性对照值和阴性对照 (S386A), 将阳性对照设置为 1, 负控制为0。
9. 使用回归和离群删除 (溃败) 方法清除异常值的数据, 将最大错误发现率设置为1%。
10. 通过将每个突变条件 (或突变体) 的数据与 "重量" 活动的平均值进行比较 (规范化为 1) 来评估统计学意义上的差异。使用 Sidak 法和α = 0.05 进行多个配对t检验, 修正多种比较。

高通量的蛋白质分解测定方法依赖于克服三大挑战。首先, 为了克服单周转 PCSK9 蛋白酶固有的低产量, PCSK9 蛋白酶缺乏抑制 prodomain, 与分裂序列的 prodomain 链接到一个荧光素酶, 可以分泌¹⁴。第二, 为了满足蛋白酶在复合体中的折叠与抑制 prodomain 的需要, 这两种多肽在细胞 coexpressed^15,16,通过一个 bicistronic 的载体在反式中。第三, PCSK9 蛋白酶在 C678 中被截断, 防止 PCSK9 复合物从内质网 (ER) 中 uncleaved, 但对蛋白水解功能^17、18 无影响..结合起来, 这允许评估分泌的荧光素酶作为一个代理的存在和程度的 PCSK9 蛋白水解 (图 1A)。化验的一般时间是短的, 以站点定向诱变的步骤对化验载体 (天 1-2) 其次是瞬变转染 (天 3) 和荧光素酶读数 (4 天) 所有完成在迅速地4天, 以极小的 "动手时间 (图 1B)。

总的来说, 这一分析允许同时评估在各种条件下的 PCSK9 蛋白水解, 并通过荧光素酶测定的读数。在采集和处理后, 可以用热图或表格格式来可视化数据。特别是, 编码 SNPs 的突变分析非常适合这种方法。图 2显示了一个饱和突变库的热图, 它通过 P6 "P6 基站上的 PCSK9 蛋白酶的裂解序列特异性。结果表明, 最佳解理序列与小波序列基本相同 (SSVFAQ |SIPWNL)。特别是, P6 或 P4 通过 P1 的残留物的突变是不耐受的蛋白酶, 符合浅, 疏水性结合槽为这些位置在晶体结构的成熟, 裂 PCSK9。从抑制剂的发展角度来看, 这一窄序列特异性剖面是一个有用的发现, 因为它表明, 没有理想化的基板模拟可以击败内生的分裂序列。图 3显示了在临床上描述的无义 snp 库的相对切解活动 (与重量相比), PCSK9 的主要结构进行了绘制。在评估的84个 SNPs 中, 超过一半的活性与蛋白蛋白酶相比有显著的变化。这些结果表明, PCSK9 蛋白水解活性的改变在临床人群中确实相当普遍, 这种改变可能有助于解释在临床上看到的 LDL 胆固醇水平的变异性。

图 1:反PCSK9 解切法中高通量的总体示意图。(A) 本小组展示了这里提出的化验的生物化学示意图。该基底包括 PCSK9 信号序列 (暗灰色) 和 prodomain (红色) 链接到的荧光素酶, 可以分泌 (NLuc, 绿色) 的 PCSK9 分裂序列 (黄色)。蛋白酶由信号序列 (暗灰色)、催化域 (浅灰色) 和含有 C679X 截断的半胱氨酸-组氨酸富 (人权) 域组成。基质蛋白酶对是 coexpressed 在 2 a 基 bicistronic 载体的化学计量学量, 服从遗传操作。共表达后, 蛋白酶和基质共折, 并保持在内质网 (ER) 中的螯合。随着卵裂活性, 荧光素酶从复杂和分泌物中解脱出来, 在那里可以通过条件培养基的荧光素素测定来检测。对裂解活动的潜在扰动包括但不限于基因操作 (摄动 A) 或小分子的存在 (摄动 B)。(B) 本小组显示了整体化验的时间线。在-1 和0天对该质粒进行现场定向诱变, 其次是1天的转染和2天的荧光素酶检测, 总时间为4天。这个数字已经从 Chorba等。⁸.请点击这里查看这个数字的更大版本.

图 2: PCSK9 蛋白酶的序列特异性.(A) 该热图显示了 P6 的饱和诱变文库中的每一个氨基酸突变体, 通过 P6 的裂解序列, 对背景和重量进行规范化的蛋白水解活动。小波序列标识显示在底部, 其中的小波序列的值显示在顶部, 并由白色矩形突出显示。值 0 (黑色) 表示背景活动, 值为 +1 (绿色) 表示 value 值。(B) 此热图显示了同一饱和突变库中的蛋白质分解值的标准偏差, 在黑色和更高值的红色中值较低。白色虚线矩形中的值表示突变体, 其蛋白蛋白酶的蛋白质分解值明显不同, 由圣 Sidak 矫正, 与α < 0.05 的未配对t检验所确定。所显示的数据来自3独立实验, 每项测试包含3个复制。这个数字已经从 Chorba等。⁸.请点击这里查看这个数字的更大版本.

图 3: PCSK9 SNPs 对蛋白水解功能的影响.(A) 此面板显示了 PCSK9 的主要结构, 其中包含信号序列 (SS; 黑色轮廓), prodomain (红色轮廓), 催化域 (灰色轮廓) 和半胱氨酸-组氨酸富域 (人权中心; 蓝色轮廓)。(B) 这个小组显示了84临床 SNPs (黄色长方形与黑色轮廓) 放置在蛋白质水解试验, 映射到主要结构的位置。(C) 本小组显示47位 SNPs 的价值, 其蛋白水解活性显著改变, 与 Sidak 蛋白酶 (α < 0.05) 所确定的未配对t检验结果相比较。这些值被映射到 PCSK9 的主结构上, 值为-1 (红色), 表示没有蛋白水解活动, 并且值为 +1 (青色), 表明对该蛋白蛋白酶有2倍的改善。这个数字已经从 Chorba等。⁸.请点击这里查看这个数字的更大版本.

表 1: 现场定向诱变 PCR 底漆设计.PCR 引物有部分重叠序列, 根据显示的设计。一个成功的底漆对的例子显示在表下面。请单击此处下载此文件.

表 2: 用于现场定向诱变的 PCR 成分.这些组件应按列出的顺序添加, 混合物保持在冰上直到反应开始。

表 3: PCR 的建议循环参数.建议的参数表示一个良好的起点, 但可能需要优化。

表 4: 测序的验证底漆.每个引物都已成功地用于排序的编码区域的质粒引用的方法。

表 5: 荧光素酶读数用2x 腔肠素试剂的成分.对所分析的每一个井都需要非裂解和裂解试剂, 以分别评价条件培养基和转染细胞。在添加腔肠素之前, 试剂混合并过滤。腔肠素添加后, 保护试剂免受光照, 直至准备使用。

上述实验程序提出了一种克服单周转蛋白酶 PCSK9 内在低活性的方法, 并以稳健的方式评价其蛋白水解功能。该检测的关键概念依赖于将单个周转事件转换为酶放大读数。该检测的优点包括相对较短的时间框架和易用性荧光素酶的记者, 以及它的可伸缩性高吞吐量的方法。此外, 该化验结果评估蛋白质水解在其本机, 细胞的上下文。此外, 通过这种检测, 临床鉴定的 snp 可以评估其对 PCSK9 蛋白水解的影响, 而不需要任何人或病人组织;只有兴趣基因型的知识是必要的。

这项试验的一些技术局限性存在。虽然该检测评估细胞内的蛋白质水解, 它也需要过度表达的载体。由于该检测要求 HEK293T 细胞系的瞬态转染, 转染效率增加了内在的好-好变异性。蛋白酶-死 S386A PCSK9 作为蛋白质水解的阴性控制, 它也作为对转染本身的积极控制, 因为这些细胞产生功能, 虽然 intracellularly 被困, 荧光素酶。对细胞板的原始数据进行评估有助于识别出转染效率总变异的细胞, 这些数据可以被丢弃 (如果需要的话, 实验重复)。此外, 处理所产生的总荧光素酶分泌的酶的比例的数据有助于调整质粒交付和转录输出的较小变化。这种变异预计会影响细胞和条件培养基的荧光素酶输出。此外, 用于这种化验的载体可以形成诱导的, 等基因系稳定的细胞系与商业上可用的 Flp-在 T-雷克斯293线, 这已经成功地作为一种手段, 以绕过脂介导的要求转 染。这可能是一个有吸引力的特点, 当应用于小分子筛查 PCSK9 蛋白降解抑制剂。迄今为止, 没有发现这种抑制剂, 进一步强调了这一化验的重要性。

PCSK9 蛋白酶的工程也产生了一些生物学上的局限性。首先, 该检测措施分子间 PCSK9 蛋白水解, 而不是分子内蛋白水解发生的 PCSK9。虽然这两种活动通常是相互关联的, 但在所有生物情况下都不太可能存在这种相关性, 因此在某些情况下, 可能采用另一种方法来验证独联体PCSK9 裂解法中的这些效应。如应用免疫印迹, 可能需要。此外, 该检测只能评估无义 SNPs (而不是非编码变化的影响)。最后, 虽然 PCSK9 蛋白水解是 PCSK9 分泌的速率限制步骤, 而 PCSK9 蛋白水解的减少预计会导致功能损失 PCSK9 变体 (关于临床胆固醇表型), 这是不正确的所有 SNPs, 表明至少对于某些突变, 额外的生物学是在发挥⁸。

这种检测的效用在于它能够评估一种内在的低输出蛋白酶的蛋白水解功能。这些设计概念应该翻译成蛋白酶以外的 PCSK9, 遭受类似的挑战。要进行这种修改 , 必须保持和荧光素酶分泌之间的联系。将基板替换为 I 型膜锚的策略,通过特定于所述的蛋白酶的裂解序列与荧光素酶相连接, 应满足此要求。

总之, 本协议描述了一种以高通量方式评估 PCSK9 蛋白质水解的方法。该方法对评价临床 snp 对 PCSK9 蛋白水解的影响, 以及对 PCSK9 小分子抑制剂的筛选有一定的参考价值。

作者没有什么可透露的。

提交人感谢 NHLBI/nih (K08 HL124068 和 LRP HMOT1243)、NCATS/nih 通过 UCSF 临床和转化科学研究所催化剂方案 (UL1 TR000004)、UCSF 学术参议院、赫尔曼基金会提供的慷慨资助,基列科学研究学者奖, 辉瑞渴望心血管奖 (全部对 John s Chorba) 和霍华德休斯医学研究所 (阿德里 m. 盖文和凯万 m. Shokat)。