大鼠体内部分肝工程的外科技术基础

建立了大鼠体内单肝叶灌注模型的新手术技术, 为今后进一步研究活体部分肝工程提供了前提条件。

器官工程学是一种新的策略来产生肝脏器官替代品, 可能被用于移植。最近,体内肝脏工程, 包括体内器官去细胞后重写, 已成为一个有希望的方法, 在体外肝工程。然而, 术后生存没有实现。本研究旨在研制一种新的大鼠体内选择性肝叶灌注手术技术, 作为体内肝脏工程的前提条件。我们只通过左外侧叶产生电路旁路。然后左侧叶血气生理盐水灌注。实验以4组 (每组n = 3 只鼠) 为基础, 不同的灌注时间为20分钟、2小时、3小时和 4 h. 生存, 以及在宏观上可见变化的颜色和组织学上确定的血细胞缺乏门户三合会和正弦波, 被作为一个成功的模型建立的指标。左外侧叶选择性灌注后, 我们观察到左外侧叶确实由红色转为淡黄色。在组织学评估中, 在门静脉、中心静脉和正弦波的分支中没有血细胞可见。左外侧叶在重新打开被阻断的血管后变红。12/12 只老鼠在手术中存活了一个多星期。我们是第一个报告一个手术模式的活体单肝叶灌注与长期生存期超过一周。与先前发表的报告相反, 这里提出的技术最重要的优点是在整个过程中保持70% 的肝脏灌注。该技术的建立为大鼠体内部分肝工程提供了基础, 包括去细胞和 recellularization。

器官移植的适应症不断扩大。相比之下, 器官捐献率和器官整体质量正在下降, 导致对移植物的需求增加。在肝脏移植等待名单中增加的候选人数继续增加 (例如, 在美国, 2016年增加了11340名患者, 与2015年的10636相比)¹。尽管作出了大量努力, 但现有器官的数量并不满足临床需要。由于肝病发病率的增加, 许多终末期肝病患者死于移植等待名单, 在捐赠器官成为可利用之前。为满足对供肝移植的巨大需求, 目前正在积极推行采用肝组织工程原理的替代方法²。目前, 一种新研制的肝脏工程生物技术有可能克服这一不足。

肝脏工程由两个步骤组成: 一个脱细胞支架的产生, 其次是支架的重写。为了获得生物脱细胞肝支架, 说明肝通过血管系统灌注离子或非离子洗涤剂, 可以去除肝脏中的细胞材料。在以往的大多数研究中, 用 TritonX100 钠和月桂酸盐联合灌注肝脏, 实现了一种生物脱细胞肝支架。因此, 所有细胞都被移除, 而细胞外基质的结构得以维持。reseeded 的器官支架与成熟细胞、肝细胞以及内皮细胞系和原发肝细胞有或不同时应用内皮细胞或间充质干细胞 (MSC)。大多数研究人员专注于体外肝脏工程^{3,4,5,6,7,8,9},^{10, 11,12,13,14}。然而, 在以前的研究中, 只有小块的填充支架立方体被移植到不同的异位植入部位。在一些研究中, 部分填充支架移植为辅助移植。然而, 最大报告的生存时间只有72小时^8,14。据我们所知, 填充全肝移植的原位移植尚未进行或发表。工程器官的长期功能和移植仍处于起步阶段。因此, 需要另一种方法来进行活体肝脏工程。

在活体肝工程中, 可能是在生理条件下研究肝重写的一种替代方法。与体外肝工程相比, 体内肝脏工程的优越性是多方面的。体外填充部分肝支架采用适当的温度、充足的氧、养分和生长因子与人工培养基进行体外灌注对比, 进行生理血液灌注。此外, 其余部分正常肝脏维持肝功能, 主要允许长期生存。由于植入的体外工程肝移植仍然无法维持实验动物的长期生存, 其肝功能⁸, 我们设想在体内部分肝 engineeringwould 最终成为一个有前景的模型, 以进一步研究工程肝的进化与更长的生存观察比体内。

最近, 一个研究小组 (潘和同事) 首次提出了在体内肝脏工程的技术¹⁵。尽管解剖和技术上的挑战, 他们实现了活体大鼠右下肝叶的分离灌注。他们报告了在体内重写使用大鼠原发性肝细胞系的第一个术中结果。然而,在体内手术灌注模型的 Pan等。有缺点。他们以完全阻断门静脉和下腔静脉为代价, 在大鼠中实现单肝叶灌注, 可能对动物造成严重损害。实验鼠仅在术中观察时间6小时后牺牲。因此,体内肝叶灌注技术需要进一步改善, 才能实现术后生存。

我们开发了一种新的活体肝叶灌注生存模型, 根据前人对¹⁶大鼠肝脏解剖的研究, 门静脉插管技术在小鼠¹⁷的血流动力学监测和肝脏生物工程^18,19. 程序的关键步骤见图 1A - 1E。

该技术适用于那些想使用本实验的活体灌注模型, 用于药物输液部分器官治疗的基础研究,体内去细胞作为器官疾病的化学切除术 (如:, 肝癌),体内细胞培养中的瓣膜基质比较了体外二维和三维细胞培养系统^{20、21、22、23,24,25,26}、在活体肝工程中由去细胞和重写。

所执行的住房和所有程序都符合德国动物福利立法。在手术前, 所有纱布、覆盖衣物和手术器械均经过蒸压和准备。所有的程序都是在无菌条件下进行的。

1. 大鼠手术过程的制备

1. 将大鼠放在感应腔内, 麻醉4% 汽化异氟醚, 100% 氧0.5 升/分钟, 直到大鼠完全麻醉。
2. 把老鼠从感应室取出, 测量它的体重。
3. 剃掉腹部手术部位的皮毛。
4. 将动物放回异氟醚腔内, 再加2分钟, 以加深麻醉。
5. 把老鼠放在手术台上仰卧。
6. 将麻醉面罩固定在大鼠的口腔区域, 并保持动物麻醉, 连续气流2% 汽化异氟醚和100% 氧气, 流速为0.5 升/分钟。
7. 用胶带固定四肢。
8. 在两眼上应用兽医软膏以防止干燥。
9. 管理丁丙诺啡0.05 毫克/公斤皮下, 以减轻疼痛在手术期间。
10. 用3发碘酊对腹部的外科手术场进行消毒, 然后2轮70% 酒精。
11. 将消毒纱布放在切口的附近, 只会使腹部的手术部位暴露。
12. 在大鼠脚趾夹戒反射时, 进行手术。

2. 大鼠开腹术

1. 用剪刀和电凝固做一个横腹皮肤和肌肉切开术。
2. 使用4-0 聚丙烯缝合固定和拉剑突的过程朝向头部。
   注: 注意提高垂直剑突过程, 以更好地暴露肝脏, 但要小心, 避免严重的呼吸道限制和窒息。
3. 用两个右肋钩将腹壁两侧拉向头部以暴露肝脏, 打开腹腔腔。
4. 用湿纱布覆盖腹腔内的十二指肠和小肠, 避免干燥。
5. 抬起左, 右正中裂片, 使用湿纱布, 并举行他们对胸部, 以更好地暴露出肝脏的脐。
6. 将老鼠置于显微镜 (8X 倍放大) 下。
7. 每隔几分钟将一些温盐水放进腹部, 放到肝脏和肠道的表面, 以防止整个过程中的干燥。

3. 在左外侧叶内建立旁路通道

1. 解剖左门静脉和结扎6-0 丝缝合在基地 (图 2A)。
2. 阻断左肝动脉, 左胆管沿左中位门静脉, 左中位肝动脉, 左正中胆管与微钳, 以防止灌流液流到左正中叶 (图 2B)。
3. 用微型剪刀将叶周围的韧带切开, 将左侧叶分开。
4. 左侧肝静脉通过夹紧在左侧侧瓣的底部与微夹 (图 2C)。
   注意: 请确保不要将左门静脉夹紧, 同时也要小心。
5. 使用蚊子钳持有左门静脉结扎, 保持静脉与适当的张力, 以便以后插管。
6. 小心地在左门静脉的前壁切开切口用 24 G 针居住导尿管 (图 3A)。
   注意: 要创建旁路, 需要在左门静脉和左肝静脉的血管通路点。对于这个步骤, 最好是通过用针刺穿血管而不是用剪刀做一个较大的切口来创建血管通路。这减少了出血和后狭窄的风险。
7. 取出导管, 取出导管中的针头, 获得无针24克导管。
8. 将导管连接到灌注管, 其中另一个端点连接到一个20毫升的注射器, 在灌注泵上用15毫升40血气生理盐水。
9. 打开泵灌注管, 从管中排出空气和无针导管。
10. 关闭灌注泵。
11. 再次,通过静脉穿刺切口将无针导管插入左门静脉 (图 3B)。
    注: 由于固定导管的空间非常有限, 目前尚不确定。因此, 外科医生应小心避免空心导管的移位。
12. 小心地在左外侧肝静脉外露区域的边缘切开另一切口, 用22或24克针式留置导管穿刺 (图 3C)。
    注: 建议导管略小于容器。
13. 取出导管, 取出导管中的针头, 获得无针22克导管。
14. 打开灌注泵, 灌注血气生理盐水进入左侧叶,通过24 克空心无针左门静脉导管, 流速为0.5 毫升/分钟。
15. 使用干纱布在左外侧肝静脉切开区周围吸收流出的废液。
16. Cannulate 左侧肝静脉通过穿刺切口的静脉与22克无针导管, 产生一个液体出口, 以减少腹部内污染 (图 3D)。
    注意: 在技术上很难将空心导管固定在肝叶上。因此, 外科医生应注意避免导尿管的移位。另外, 如果不用导管插管左外侧肝静脉, 废液也可在静脉切口区内仅用干纱布吸收。
17. 保持灌注左侧叶与血气生理盐水约20分钟 (组 1), 然后只有生理盐水2小时, 3 小时, 或 4 h (组 2, 组 3, 和组 4, 分别)。
18. 关闭泵以停止灌注。

4. 左外侧叶的生理再灌注

1. 从左门静脉和左外侧肝静脉中摘下两个导管。
2. 用11-0 聚酰胺缝合闭合左门静脉切口。
3. 用11-0 聚酰胺缝合闭合左外侧肝静脉的切口。
4. 松开左外侧肝静脉。
5. 松开左中位门静脉, 左胆导管, 左肝动脉。
6. 切断左门静脉的结扎, 重新打开静脉。

5. 腹壁闭合

1. 用4-0 可吸收的 polyglactin 910 缝线缝合, 闭合腹壁的肌肉层。
2. 用4-0 可吸收的 polydioxanone 缝合闭合腹壁的皮肤层。
3. 关闭腹部后, 用70% 酒精消毒皮肤切口。

6. 大鼠术后治疗

1. 把动物放在温暖的垫子上, 进行10分钟的复苏, 然后把它放进一个新笼子里。
2. 0.05 毫克/千克每天皮下 2x, 连续 3 d, 术后释放疼痛。

十二例男性 (12-13 周) Lewis 大鼠用于评价选择性肝叶灌注的效果。实验以四组 (每组 3只鼠) 进行。使用不同的灌注周期20分钟, 2 小时, 3 小时, 4 小时, 按照上述步骤, 我们成功地在活体单叶灌注。

体内左外侧叶灌注:

血气生理盐水灌注后左门静脉和左外侧肝静脉、左门静脉和左外侧肝静脉插管的准确解剖鉴定。一个成功的识别和插管的第一个指标是观察, 血液混合灌流液是流出左侧叶通过液体出口 (图 4A)。通过观察血气盐水灌注后左外侧叶颜色的变化, 进一步证实了成功的手术灌注模型。左外侧叶的颜色从明亮的红色变淡黄色, 表明从左外侧叶的血液去除。为证实剩余裂片的生理灌注维持, 左外侧叶灌注时, 残留肝叶的颜色不断观察。左外侧叶的正确灌注导致叶变淡黄色, 而其余的肝叶在整个过程中保持其鲜艳的红色 (图 4B)。

左外侧叶的生理再灌注:

为评估空心血管在闭合血管切口和重新打开血管后的通畅性, 观察左外侧叶的颜色变化。在左外侧肝静脉重新开放后, 在左外侧瓣的灌注下, 出现了一些红色斑点, 表明左侧侧叶的初始逆行灌注 (图 5A)。靶叶的表面在释放左肝动脉、左胆管和左正中门静脉的微夹后显示出更多的红点, 这意味着左侧叶的进一步生理灌注通过重新开放船只 (图 5B)。靶向肝叶的表面在重新打开左门静脉后变暗红色, 确认靶向肝叶通过左门静脉恢复其完整的生理灌注 (图 5C)。

左外侧叶灌注的组织学:

经血气生理盐水或生理盐水灌注后, 选择性灌注左外侧叶 (实验), 正常下尾叶 (对照) 切除并固定甲醛, 然后进行组织学检查 (H& Estaining)。在左外侧叶, 在门静脉、正弦波和中心静脉的分支中没有明显的血细胞可见。如预期, 红细胞在肝动脉的分支可见 (图 6A和6C)。在正常下尾状叶 (作为对照) 中, 血细胞在门静脉、正弦波和中心静脉的分支中明显可见 (图 6B和6D)。

成活率:

十二出十二只实验鼠, 1 周生存率为100%。然而, 3 只经过4小时灌注的实验鼠在术后第二或第三天暂时从眼中腹泻和流血流出。

图 1: 手术方案体内单肝叶灌注模型.(一) 这是一幅关于大鼠肝脏解剖的示意图。(B) 本小组显示左门静脉、左肝动脉、左胆管、左正中门静脉及左外侧肝静脉阻塞。(C) 本小组显示左门静脉插管和左外侧肝静脉导管用于液体入口和出口。(D) 本小组通过灌注泵显示左侧叶与血气生理盐水的灌注。(E) 本小组在重新开放被阻断的血管到裂片后, 显示左外侧叶的生理再灌注。请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: 术中图像显示左侧侧叶供应和引流的血管堵塞.(A) 本小组显示左门静脉结扎。(B) 本小组显示左肝动脉、左胆管及左中位门静脉/肝动脉/胆管阻塞的微夹。(C) 本小组以微夹 (白箭) 显示左外侧肝静脉的堵塞。刻度条为1毫米.请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:术中图像显示左侧侧叶旁路循环.(A) 本小组在左门静脉 (白色箭头) 上用24克针置导管穿刺, 显示切口。(B) 本小组显示左门静脉插管为带24克无针导管 (白色箭头) 的流体入口。(C) 本小组在左外侧肝静脉 (白色箭头) 的切口上用22克针置导管穿刺。(D) 本小组显示左外侧肝静脉插管为一个22克无针导管 (白色箭头) 的液体出口。刻度条为1毫米.请单击此处查看此图的较大版本。 

图 4: 术中影像显示左外侧叶灌注.(A) 本小组显示灌流液通过入口 (黄色导管) 流向左侧叶, 并通过出口 (蓝色导管) 流出左侧叶。左外侧叶确实有选择性地灌注, 如叶 (白色箭头) 的颜色变化所示。(B) 注意左外侧叶在血气生理盐水灌注后呈淡黄色的变化, 而其余的肝叶则保持亮红色 (白色箭头)。刻度条为1毫米.请单击此处查看此图的较大版本。

图 5: 左外侧叶的生理再灌注.(A) 本小组显示左外侧瓣重开左外侧肝静脉 (白色箭头) 后的逆行灌注。(B) 本小组在左中位门静脉和左肝动脉释放微钳后, 显示左外侧叶 (白色箭头) 的生理再灌注。(C) 本小组在重新开放左门静脉和左正中叶缺血 (蓝箭) 后, 显示左外侧叶 (红色箭头) 的完全再灌注。刻度条为1毫米.请单击此处查看此图的较大版本。

图 6: 组织学评估 (H & E 染色).(a和C) 这些小组对肝素-盐水灌注左外侧叶 (实验性裂片) 进行组织学评估, 表明(a) 门静脉和正弦波中没有血细胞, (C)中心静脉。然而, 如预期的那样, 红细胞在肝动脉 (黑箭) 中可见。(b和D) 这些小组对正常下尾叶 (控制) 的组织学评估显示所有血管结构中的血细胞: (B) 门静脉、肝动脉和正弦波 (黑色箭头),和 (D) 中心静脉 (黑色箭头)。刻度条为250µm。

参数	结果
研究组	平底锅 et al 2016 [15]	自己的组
体内	是的	是的
靶肝叶	右下叶	左外侧叶
腔静脉堵塞与主门静脉阻塞	是的	不
剩余裂片缺血	是的	仅左正中叶
腔静脉插管	是的	不
主门静脉插管	是的	不
门静脉高压症	是的	不
1周生存率	牺牲术	100%

表 1.不同模型的比较体内肝脏工程学.这张表显示了在两个模型机构之间的关键差异泛美等。¹⁵和我们的研究小组。

通过阻断和 cannulating 左门静脉与导管作为流体入口和左外侧肝静脉与另一个导管作为液体出口, 我们成功地产生了体内液体旁路在左外侧叶, 表明虽然该技术是非常具有挑战性的, 由于导管的体积小, 造成出血的高风险, 这是可行的。即使是长时间灌注4小时的老鼠至少存活了1周, 表明大鼠可以忍受这种手术过程。

在下一节中, 我们描述了三技术上最困难和最关键的步骤, 以及如何成功地掌握它们。首先, 在左门静脉的分离和结扎过程中, 由于靶向门静脉与周围肝实质的密切空间关系, 血管的分离有很高的出血危险。我们建议使用微钳而不是剪刀分开左门静脉, 通过仔细撕裂的连接的缺血性组织周围的左门静脉。其次, 在左门静脉前壁切口上, 左门静脉前壁超大切口可能会增加切口修复的难度和血管吻合后引起狭窄的可能性。我们建议使用针居住导管, 而不是剪刀做一个适当大小的切口。第三, 对于左外侧肝静脉的堵塞, 如果左外侧肝静脉外露区不正确堵塞, 左外侧肝静脉将不会有足够的暴露空间供以后插管。我们建议, 夹紧应执行接近左正中叶, 而不是在暴露区域中间的左外侧肝静脉。

我们比较了两种选择在体内肝脏灌注的模型. ¹⁵和我们的 (表 1)。首先, 靶向肝叶的选择被认为是模型建立最关键的一步。我们选择了一个相当孤立的叶, 左外侧叶, 作为靶向瓣在体内手术灌注模型建立。相比之下, Pan 的研究组选择了¹⁴模型的右下叶。选择右下叶的缺点如下: 首先, 他们必须通过完全阻断和 cannulating 腔静脉对液体出口进行折衷, 这可能对动物的血液循环产生负面影响。其次, 他们不得不阻断和 cannulate 入口的主门静脉, 导致其余肝叶缺血, 门脉高压。相对于这里的裂片, 左外侧叶, 我们堵塞和空心左外侧肝静脉, 而不是腔静脉的液体出口。我们通过选择左门静脉产生一个流体入口, 它的直径相当大, 便于解剖、堵塞和插管。因此, 在本文所提出的模型中, 可以避免直接阻断血流到腔静脉和主门静脉, 这对大鼠生存至关重要。

尽管在活体肝叶灌注中有很大的潜力, 但这种技术有一定的局限性。首先, 左内侧叶缺血是不可避免的, 因为在过程中左中位门静脉阻塞。其次, 根据左外侧叶底部的临时堵塞, 采用微夹紧, 这可能会导致肺基底周围的肝实质损伤, 并在血气生理盐水灌注过程中不可避免地引起轻微的渗漏。三例实验性大鼠在4小时的灌注期内暂时不受腹泻和血眼放电的影响, 提示4小时可能是大鼠的最大灌注期, 而不受并发症的影响。在我们的知识, 至少3小时是需要为整个大鼠肝脏的去细胞¹⁸。因此, 4 小时的灌注时间, 我们打算达到将足够的进一步肝叶去细胞, 这是一个先决条件, 肝工程由细胞重写的肝支架。

在未来, 这种新的体内灌注模型技术可能被用于药物输液部分器官治疗的实验研究, 在体内部分器官去细胞作为化学切除, 作为 "在体内细胞培养系统 ", 和, 可能最重要的是,在体内部分器官工程。

作者没有什么可透露的。

作者要感谢耶拿大学医院解剖学研究所的 Geiling, 以制作大鼠肝脏解剖示意图。