CRISPR/Cas9-mediated 目标集成在体内使用基于同源介导的端接连接策略

聚簇定期 interspaced 短回文重复/CRISPR 相关蛋白 9 (CRISPR/Cas9) 系统为基因工程提供了一个有前途的工具, 并开辟了转基因目标整合的可能性。我们描述了一种基于同源介导的端接 (HMEJ) 策略, 用于有效的 DNA 靶向集成体内和使用 CRISPR/Cas9 的靶向基因治疗。

CRISPR/Cas9 系统作为一种有前景的基因组编辑平台, 具有很好的遗传操作能力, 特别是转基因靶向整合。然而, 由于同源重组 (HR) 的效率低下, 以及非同源端连接 (NHEJ) 的各种 indel 突变, 在无分裂细胞中,体内基因组编辑仍然是一个巨大的挑战。在这里, 我们描述了一个基于同源介导的端接 (HMEJ) 的 CRISPR/Cas9 系统, 用于有效的体内精确目标集成。在该系统中, 靶向基因组和包含同源臂 (约 800 bp) 的单导 RNA (sgRNA) 靶序列的施主载体被 CRISPR/Cas9。这种基于 HMEJ 的策略在小鼠受精卵以及肝细胞体内实现了有效的转基因集成。此外, 以 HMEJ 为基础的策略提供了一种有效的方法来矫正肝细胞中的 fumarylacetoacetate 水解酶 () 突变, 并抢救缺陷致肝功能衰竭小鼠. 结合起来, 专注于目标整合, 这种基于 HMEJ 的战略为各种应用提供了一个有前景的工具, 包括基因改良动物模型的生成和靶向基因治疗。

精确的, 有针对性的基因组编辑通常需要生产转基因动物模型和临床治疗。为有效的靶向基因组编辑制定了各种策略, 如锌指核酸酶 (ZFN)、转录激活剂样效应核酸 (TALENs) 和 CRISPR/Cas9 系统。这些策略在基因组中创建目标 dna 双链断裂, 并利用内在的 dna 修复系统, 如同源重组 (HR)^1,2, microhomology 介导的最终加入 (MMEJ)^3,4,5和非同源端连接 (NHEJ)^6,7,8 , 以诱导目标集成的转基因^1,9。基于 HR 的策略是目前最常用的基因组编辑方法, 它在细胞系中非常有效, 但由于其在晚期 S/G2 阶段的受限发生而无法轻易进入非分裂细胞。因此, 基于 HR 的策略不适用于体内基因组编辑。最近, NHEJ 的策略被开发为有效的基因敲入在小鼠组织⁸。然而, 基于 NHEJ 的方法通常会在连接处引入 indels, 使得很难生成精确的基因组编辑, 尤其是在试图构建帧内融合基因⁸时。基于 MMEJ 的目标整合能够精确地进行基因组编辑。但是, 在以前的报告⁵中, 它只适度地提高了目标集成效率。因此, 在广泛的治疗应用程序³中迫切需要提高精确目标集成在体内的效率。

在最近发布的工作中, 我们演示了一种基于同源介导的端接 (HMEJ) 策略, 它在所有报告的策略中都显示了目标集成效率最高的体外和体内¹⁰。在这里, 我们描述了建立 HMEJ 系统的一个协议, 并构建了针对感兴趣的基因的单导 RNA (sgRNA) 向量, 以及窝藏 sgRNA 目标点的施主载体和800同源臂的 bp (图 1).在本协议中, 我们还描述了生成 DNA 敲除小鼠的详细步骤以及在组织中体内的目标集成的简要步骤。此外, 基于 HMEJ 的策略的概念验证研究表明, 它有能力纠正 "突变" 的变异并抢救/肝功能衰竭小鼠, 进一步揭示了其治疗潜力.

在上海生物科学研究院 (CAS) 的生物医学研究伦理学委员会批准了包括动物实验在内的所有程序。

1. 捐助者质粒的设计

1. sgRNA 的选择
   1. 使用在线 CRISPR 设计工具预测目标区域上的 sgRNAs^{11,12,13,14,15}。对于Cdx2轨迹, 设计六个不同的 sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2sgRNA6), 其周围有更高级别和较低潜在目标 (图 1)¹⁶的 stop 密码子。
   2. 进行线性化2µg 的 Cas9-CMV-EGFP 表达载体和 sgRNA BbsI 消化 (µL 1 BbsI 2 h 在37°c 在最后集中 1 U/µL 在容量20µL)。然后用1% 琼脂糖凝胶在1×泰缓冲器中纯化产品。
   3. 将一对 sgRNA 寡核苷酸混合在10µL 的 1× T4 DNA 连接酶缓冲液中, 最终浓度为50µM. 用温度梯度从95°c 孵化到25°c, 温度变化率为5摄氏度/5 分钟 (95 摄氏度为5分钟) 孵育寡聚体溶液;, 然后90°c 为5分钟, 85 °c 5 分钟,等.), 这将退火的寡核苷酸。
   4. 将退火产物的4µL、2µL 的线性化向量与1µL T4 dna 连接酶在µL 1× dna T4 缓冲区的10连接酶中, 然后结扎22摄氏度 1-2 h(图 1 B).
2. sgRNA 的测量核酸酶测定
   注: sgRNA 试验用的靶向效率由测量员核酸酶化验 (也称为 T7 限制性 I (T7EI) 化验) 17 进行评估.选择 sgRNA 的高 DNA 解切效率和低距离之间的 sgRNA 切割点和停止密码子。
   1. 染 Cas9-sgRNA-EGFP 表达载体到 N2a 细胞系中培养 DMEM 补充10% 胎牛血清, 1% 和1% 非必需氨基酸的转染套件 (见材料表)。在 5% CO₂中孵育转染的细胞在37°c。
   2. 在48小时的孵化后, 通过荧光活化细胞分类收集5000转染细胞 (GFP⁺), 并使用非转染细胞作为控制。
   3. 消化收集的细胞在2-5 µL oflysis 缓冲 (0.1% 海卫 X-100, 0.1% 吐温 20, 100 µg/毫升蛋白酶 k) 在56摄氏度30分钟, 然后热灭活蛋白酶 k 在95°c 10 分钟。
   4. 使用制造商的协议, 通过嵌套 PCR (表 1) 放大示例。PCR 产品的大小设置为 300-500 bp。
      1. 将裂解产物的1µL 与 DNA 聚合酶和一对外引物混合, 识别 sgRNA 靶点周围的序列 (0.1 µM, 最终浓度) (表 1), 并在20µL 的体积内执行主 PCR。
      2. 激活 DNA 聚合酶在95°c 5 分钟, 并执行主要 PCR 为30个周期在95°c 为三十年代, 60 °c 为三十年代和72°c 为二十四年代 (1 min/1 kb), 以最后的引伸在72°c 为5分钟。
      3. 采用1µL 的初级 pcr 产物和一对嵌套内引物进行二次 pcr。
   5. 在20µL 1× T7EI 反应缓冲器 (50 毫米氯化钠) 中变性和重新退火300-600 的纯化 PCR 产物, 10 毫米的三盐酸, 10 毫米氯化镁₂, 1 毫米的有效率的 pH 值 7.9) 使用温度梯度从95°c 到25°c 以率5°c/5 分钟。
   6. 在退火的 PCR 产物中加入1µL 的 T7EI 酶, 并在37摄氏度上消化2小时。然后在1×TAE 缓冲区中的2% 琼脂糖凝胶上运行消化产物120伏40分钟, 直到碎片分离 (参见材料表)。
   7. 使用 ImageJ 确定切割和未切割 DNA 的带强度。使用以前报告的⁹ (图 1C) 中的方法计算 indel 频率。
3. 捐赠载体的构建
   注意: 为Cdx2基因生成 HMEJ 供体向量, 构造一个供方 DNA (800 bp HAL-p2A-mCherry-800 bp), 两端有 23 nt Cdx2-sgRNAs 目标序列 (图 1D和图 1E)。靶序列的 PAM 与同源臂的末端相邻。吉布森大会建议 HMEJ 捐赠者克隆。
   1. 放大 800 bp 左同源臂 (HAL) 与前 primer-1F (包含 15-20 nt 重叠序列从向量, 23 nt Cdx2-sgRNA 目标序列, 约 20 nt 序列从 HAL) 和反向 primer-1R (包含 15-20 bp 重叠序列从p2A-mCherry 和大约 20 nt 序列从 HAL) 在0.1 µM 最后浓度使用小鼠基因组 DNA 在 200 ng/µL (图 1D,表 1)。
   2. 放大 p2A-mCherry 插入片段与前 primer-2F (包含 15-20 nt 重叠序列从 HAL 和大约 20 nt 序列从插入片断) 和反向 primer-2R (包含 15-20 nt 重叠序列从哈和大约 20 nt 序列从插入片段) 在0.1 µM 最终浓度使用基因组 DNA 或质粒与记者序列在 100 ng/µL 或 30 ng/µL (图 1D,表 1)。
   3. 放大 800 bp 右同源臂 (哈) 与前 primer-3F (包含 15-20 nt 重叠序列从向量, 23 nt Cdx2-sgRNA 目标序列, 约 20 nt 序列从哈) 和反向 primer-3R (包含 15-20 nt 重叠序列从p2A-mCherry 和大约 20 nt 序列从哈) 在0.1 µM 最后浓度使用小鼠基因组 DNA 在 200 ng/µL (图 1D,表 1)。
   4. 根据制造商的说明 (表 1), 在1×TAE 缓冲器上运行所有的 pcr 产品, 并在1% 琼脂糖凝胶上使用凝胶萃取试剂盒纯化预期尺寸的 pcr 产品。
   5. 用 KpnI 和 XbaI 消化50-100 的构造载体。混合2µL 的线性化向量在 30-40 ng/µL 与三 PCR 扩增片段 (1 µL 为每, 100-200 ng/µL) 在2x 吉布森混合。添加 H₂O 可将最终卷调整为10µL. 孵育50°c 的混合物60分钟。
   6. 根据制造商的指示, 用所有组装的产品转换合格的大肠杆菌细胞, 并提取质粒结构。通过 DNA 测序验证 HMEJ 的捐献者。

2. 利用 HMEJ 方法对小鼠胚胎进行基因组编辑

1. Cas9 mRNA 的生产
   1. 对于 Cas9 mRNA 的制备, 通过使用表 1中列出的适当底漆对, 将 T7 启动程序序列添加到 Cas9 编码区域。在最终浓度为0.1 µM 和 20 Cas9 表达载体的 Cas9 中加入底漆, 1×高保真 DNA 聚合酶组合。用 H₂O 将最终卷调整为50µL。
   2. 激活 DNA 聚合酶在95°c 5 分钟, 并执行 PCR 为36个周期在95°c 为三十年代, 60 °c 为三十年代和68°c 为4分钟 (1 min/1 kb), 以最后的引伸在68°c 为10分钟。
   3. 纯化 T7-Cas9 PCR 产品的体外转录 (IVT), 然后转录 0.5-1 µg DNA 的 mRNA 转录试剂盒在37°c 8 小时的总容积20µL, 根据制造商的说明 (见材料表)。
   4. 添加1µL 的 DNase 的混合物, 以删除 DNA 模板在37°c 15 分钟. 在37°c 添加一个聚 a 尾45分钟, 并通过 RNA 纯化试剂盒恢复 Cas9 mRNA, 根据制造商的说明 (请参阅材料表)。
2. sgRNA 生产
   1. 生成 sgRNA 模板驱动的 T7 启动者与高保真 DNA 聚合酶如上所述。选择一个包含矢量的 sgRNA 脚手架作为模板。使用的引物列在表 1中。
   2. 纯化 T7-sgRNA PCR 产品, 并使用 0.5-1 µg DNA 作为体外转录的模板, sgRNA 使用短 RNA 转录试剂盒, 在20µL 的总容积中, 在37°c 为6小时, 按制造商的说明 (参见材料表/c11>)。
   3. 添加1µL 的 DNase 的混合物, 并继续孵化在37°c 15 分钟删除 DNA 模板。用 RNA 纯化试剂盒净化 sgRNAs (见材料表)。
   4. 将 sgRNA 稀释至500µL RNase 水中, 并将样品保存在−80°c, 长达3月。
      注: CRISPR ribonucleoproteins (RNPs) 是替代替代品, 具有更好的切割效率^18,19,20。
3. 胚胎采集、显微注射和体外培养
   1. Superovulate 雌 B6D2F1 (C57BL/6 x DBA2J) 小鼠 (7-8 周大), 孕母马血清促性腺激素 (PMSG), 其次为人绒毛膜促性腺激素 (hCG) 48 小时后。在 hCG 注射以后, 议院女性与 B6D2F1 男性过夜。
   2. 牺牲女性由 CO₂麻醉, 24 h 在 hCG 注射以后。在 M2 培养基中收集受精胚胎的输卵管 (每个雌性的 30-50 胚)。
   3. 将受精的胚胎 (一天注射大约300颗鸡蛋) 放入 KSOM 培养基 (5.55 克/升氯化钠, 0.19 克/升氯化钾, 0.05 克/升₂PO₄, 0.05 克/升 MgSO₄7H₂O, 0.04 克/升葡萄糖, 1.12 克/升乳酸钠, 2.1 克/升 NaHCO₃, 0.02 克/l-丙酮酸钠, 0.25 克/升 CaCl₂· 2H₂O, 0.004 克/升 EDTA, 0.146 克/升谷氨酰胺, 1 克/升牛血清白蛋白), 在37摄氏度的孵化器与 5% CO₂。
   4. 混合 Cas9 mRNA (100 ng/µL)、sgRNA (50 ng/µL) 和 HMEJ 捐助向量 (100 ng/µL), 并添加 H₂O 将最终卷调整为10µL. 把混合物放在冰上。
   5. 拉毛细管针 (外径1.0 毫米, 内径0.78 毫米与灯丝) 使用微拉出器 (参数: 热, 74; 拉, 60; 速度, 80; 时间/延迟, 200; 压力, 300。请参阅材料表)。商业针头可以替代微注射。
   6. 在含有5µg/毫升细胞松弛素 B 的 HEPES-CZB 介质液滴中, 将混合物的可能体积注入受精卵的胞浆中, 并使用具有恒定流设置的 microinjector(图 2 a) (参见 材料表)²¹。
      注: 每组受精卵应在20-30 分钟内注射细胞松弛素 B 可提高注射后小鼠受精卵的存活能力。或者, 显微注射可以与压电系统一起操作, 如前所述²²。
   7. 培养注射受精卵在 KSOM 培养基在37°c 在 5% CO₂之下直到胚泡阶段在3.5 天以后为荧光观察 (图 2B和 2C)。
4. 小鼠胚胎移植及生成的研究
   1. 输精管切除术雄性小鼠与注射剂在同一天发情的雌性小鼠交配。
   2. 培养注射受精卵入2细胞阶段在37°c 在 5% CO₂之下, 并且转移 25-30 2 细胞胚胎到 pseudopregnant 的输卵管在0.5 天后 coitum (dpc)。接受的母亲送幼崽在 19.5 dpc。
5. 鼠标基因分型
   1. 根据制造商的说明 (请参阅材料表), 使用 DNA 提取试剂盒从脚趾或尾部样品中提取小鼠基因组 dna。
   2. 用紫外/可见光谱测量的 200-400 ng 基因组 DNA, 确定 5 ' 和 3 ' 的敲接事件, 作为模板进行 PCR amplification。
      1. 激活 DNA 聚合酶在95°c 5 分钟, 并执行 PCR 为38个周期在95°c 为三十年代, 60 °c 为三十年代和72°c 为1分钟 (1 min/1 kb), 以最后的引伸在72°c 为10分钟。对于 5 ' 连接, 使用前底漆在 HAL 的上游, 与反向一个在敲入片段 (p2A-mCherry)。至于 3 ' 结, 使用前底漆在敲入片段 (p2A-mCherry), 与反向一个在下游的哈 (表 1)。
   3. 运行6µL 的 PCR 产品1% 琼脂糖凝胶在1×TAE 缓冲和检查预期的片段大小。然后通过 DNA 测序验证它们 (图 2D)。

3. 肝细胞中基于 HMEJ 的体内基因组编辑

1. 将收件人 C57BL/6J 鼠标 (8 周) 放在一个限制装置中, 并将尾部通过狭缝。
2. 在2毫升盐水溶液中混合 HMEJ 供体载体 (30 µg) 和 spCas9 表达载体 (30 µg)。对于控制实验, 在2毫升盐水溶液 (图 3A) 中挂起 HMEJ 供体向量 (30 µg)。
3. 用70% 乙醇清洁鼠标尾部。将针插入尾静脉, 并在5-7 秒内注入质粒 DNA 溶液. 取出针头, 从抑制装置中松开鼠标。
4. 在注射后5-9 天后通过 CO₂麻醉来牺牲老鼠。灌注小鼠 transcardially 0.9% 生理盐水, 然后用蠕动泵4% 多聚甲醛, 并在4摄氏度一夜之间修复肝脏。
5. 在一夜之间用30% 蔗糖脱水组织, 直到它沉到管子的底部。
6. 切片的冷冻组织在厚度为10µm 的肝脏样本。
7. 冲洗三次在0.1 米磷酸盐缓冲 (PB) 和孵化他们的主要抗体: 兔抗 mCherry (稀释在 5%) 隔夜在4摄氏度。
8. 在 PB 中洗涤三次, 然后用二级抗体孵化: Cy3-AffiniPure 山羊抗兔 IgG, 在室温下在眼眶上进行2小时的免疫。
9. Counterstain 部分与 DAPI 20 分钟, 并在玻璃幻灯片上安装甘油, 以进一步荧光观察 (图 3B)。

在小鼠胚胎中基于 HMEJ 的基因组编辑:为了定义小鼠受精卵中基于 HMEJ 的方法的敲除效率, 我们将 Cas9 mRNA、sgRNA 靶向Cdx2基因和 HMEJ 捐献者放入鼠标受精卵中, 该基因被设计用来将 p2A-mCherry 报告器中的一个子项与 Cdx2 的最后一个密码子结合起来. 基因 (图 2A)。注射的受精卵发展成囊胚在文化中。为了评价 mCherry 荧光的有效性, 我们用荧光显微镜对其进行了分析, 发现12.9% 的囊胚接受 HMEJ 捐献者是阳性的 mCherry, 这在滋养外胚层中严格表达 (图2B、2C)。通过对 PCR 阳性小鼠进行排序, 我们还发现所有检测到的集成事件都是 5 ' 和 3 ' 连接点的精确帧内集成 (图 2D)。

基于 HMEJ 的基因组编辑在成人组织和 HMEJ 介导的基因治疗:为了研究 HMEJ 基因组的编辑是否可以应用于成人组织, 我们在Actb基因的停止密码子前插入 mCherry 盒, 传感ActbHMEJ 构造 C57/B6J 小鼠肝的尾静脉流体力学注入 (图 3A)。经过7天的注射, 我们发现近半数的转染肝细胞表达 mCherry 染色在肝脏部分 (图 3B)。

为了探讨使用 HMEJ 的基因治疗策略的可能性, 我们使用了 fumarylacetoacetate 水解酶 () 缺陷小鼠.tyrosinemia 鼠标是一种成熟的遗传性类型 I (HTI) 鼠标模型, 它在基因的外显子5中放置一个插入片段, 导致以下序列23^中的 frameshift 突变. 为了维护 trifluoromethylbenzoyl ^/小鼠, 我们用酪氨酸分解通路上游的抑制剂, 2-(2-硝基-4-)-13-cyclohexanedione (NTBC) 24 处理了.在这里, 我们出发去看看 MMEJ 和 HMEJ 介导的基因矫正是否能拯救/鼠标中的. 突变. 我们水力注入 Cas9 构造和-MMEJ 或 HMEJ 构造, 旨在将5到14的子显式 cDNA 插入遗传基因的内含子 4, 到. ^- 小鼠肝脏 ( 图 3C). 注射后一周, NTBC 被撤回以诱发肝脏损伤 (图 3C)。在 NTBC 退出后, HMEJ 小鼠接收的纠正肝细胞比基于 MMEJ 的方法显示更有效的扩散 (图 3 D ).

图 1: HMEJ 介导的目标集成体外.
(A) 选择 sgRNAs 的实验方案: 六个不同的 sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2sgRNA6) 基于在线 Cdx2 设计选择了具有较高秩和非目标电位的CRISPR轨迹的终止密码子。工具.protospacer 相邻的母题 (PAM) 序列为红色。(B) 实验设计: 将 sgRNA、Cas9 和 GFP 表达的 Cas9-CMV-GFP 表达质粒引入 N2a 细胞。GFP⁺单元格在3天被排序为验船师化验。(C) 对Cdx2目标进行测量的检测: 6 种不同的 sgRNAs 是为测量师设计的。正常 N2a 细胞基因组 DNA 作为控制。*, 用于Cdx2的 sgRNA 2 mCherry 敲入实验。(D) 使用吉布森组件构造 HMEJ 捐助者的示意图概述。(E) HMEJ 介导的基因靶向策略在Cdx2轨迹中的示意图概述。哈尔, 左/右同源臂;三角形, sgRNA 目标站点;/或, 外向前/反向底漆;IF/IR, 内前/反向底漆。从上一个报表¹⁰修改的图。请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: 通过 HMEJ 介导的目标集成对小鼠胚胎进行基因组编辑
(A) 微注射实验方案: 将 Cas9 mRNA (100 ng/µL)、sgRNA (50 ng/µL) 和供体质粒 (100 ng/µL) 的混合物注射到小鼠受精卵中。(B) 由 HMEJ 策略编辑的小鼠胚胎的代表荧光图像。酒吧, 20 µm. (C) 按 mCherry⁺囊胚百分比表示的敲出效率。数字在每个酒吧之上, 总囊胚计数。(D) 在Cdx2轨迹上进行基因编辑的小鼠序列分析。PCR 产品从 5 ' 和 3 ' 结点被放大了测序。上部, 同源臂;紫色, p2A;红色, mCherry;或哈尔, 右或左同源的手臂。虚线标记为清晰而省略的区域。从上一个报表¹⁰修改的图。请单击此处查看此图的较大版本.

图 3: HMEJ 介导的目标集成在体内.
(A) 水动力尾静脉注射示意图概述。通过水动力尾静脉注入的方式, 表达了供体序列和 sgRNA 的质粒, 以及表达 spCas9 的质粒。(B) 代表肝细胞免疫荧光图像。肝切片采集7天后注射。缩放条, 50 µm, 转染的细胞。(C) MMEJ 或 HMEJ 介导的基因置换策略的质粒, 旨在将5到14的外显子的发 cDNA 插入到发基因的内含子4中, 并通过水动力注射将其传递到了该方法. NTBC on: NTBC ^- 小鼠保存在水上;NTBC: 撤退 NTBC 水 (NTBC 撤退的第一天被定义了0天, 是注射之后的第七天)。(D) MMEJ 的免疫组化染色, 其肝脏部分由 ^./-小鼠注射而成, 其为 HMEJ 质粒。缩放条, 100 µm 从以前的报告修改过的图^5,10。请单击此处查看此图的较大版本.

HMEJ 供体质粒的构建最关键的步骤是: (1) sgRNA 的选择, 其 DNA 解切效率高, sgRNA 切割部位与停止密码子之间的距离小, (2) HMEJ 供体的适当构造。CRISPR/Cas9-mediated 对两种转基因供体载体 (包含 sgRNA 靶点和800的 bp 同源臂) 和靶向基因组在体内进行高效和精确靶向整合是必要的.采用 HMEJ 法生成敲鼠的最关键步骤是: (1) 制备高质量的 Cas9 mrna 和 sgRNA (Cas9 mrna 和 sgRNA 中不存在变性), (2) 制备高质量 HMEJ 供体质粒。质粒对胚胎发育无毒性作用。

最近, 还报告了一种基于 NHEJ 的方法, 用于有效的体内基因组编辑⁸。然而, 如前几份报告⁸所述, 不同类型的 indel 突变通常是在结点引起的, 因此很难实现精确的集成。在这里, 我们上面描述的基于 HMEJ 的策略显示了精确的目标集成, 几乎没有任何 indel 突变。因此, 一个基于 HMEJ 的策略可以是一个理想的平台, 用正确的方法替换突变序列 (如点突变), 而不适用于基于 NHEJ 的算法。

嵌合体是胚胎基因编辑的一个主要问题。在早期胚胎阶段注射 Cas9 蛋白代替 mRNA, 可以在没有嵌合体的情况下, 在一个细胞阶段实现转基因撞击。对于临床应用, 将 CRISPR/Cas9 系统送到成人组织中仍然具有挑战性。

基于 HMEJ 的基因组编辑有许多未来的潜在用途。它可以用来产生基因改良的动物模型。考虑到它在胚胎中的高敲效率, 这种方法可以显著减少产生基因改良动物模型所需的动物数量, 特别是开辟了生成非人类灵长类遗传模型的可能性。基于 HMEJ 的基因组编辑可以沿袭在成人组织中追踪单个细胞类型, 这对于动物模型特别有用, 因为缺乏可用的动物模型, 如非人类灵长类。它可以用于靶向基因治疗: HMEJ 策略最有吸引力的应用是基因治疗的临床使用。在本研究中, 我们修正了遗传性 tyrosinemia I. 型小鼠的出突变, 并通过流体动力学注入指示载体. 然而, CRISPR/Cas9 系统进入成人组织仍然是临床使用的主要技术挑战, 因为水动力注射不太可能在患者中执行。目前, 在将这种 HMEJ 的方法转化为临床前, 迫切需要进一步完善配送策略。

作者没有什么可透露的。

这项工作得到了中科院战略优先研究项目 (XDB02050007, XDA01010409), 国家高技术研发 & 开发计划 (863 计划; 2015AA020307), 国家自然科学基金 (自然科学基金资助 31522037, 31500825, 31571509,31522038), 中国青年千人才项目 (以 hy), 突破中国科学院工程, 上海市科技委员会项目 (16JC1420202), 中国科学技术部 (大部分; 2016YFA0100500)。

An erratum was issued for: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells. The phrases "surveyor assay" and "Surveyor Nuclease" have been updated to "T7E1 assay"  to " T7 endonuclease I" respectively. 

Step 1.2 in the Protocol has been updated from:

2. Surveyor nuclease assay of sgRNA
   NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by surveyor nuclease assay (also known as T7 endonuclease I (T7EI) assay)¹⁷. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.

to:

2. T7 endonuclease assay of sgRNA
   NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by T7 endonuclease (T7EI) assay¹⁷. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.

Figure 1 in the Representative Results has been updated from:

Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro.
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP⁺ cells were sorted at day 3 for surveyor assay. (C) Surveyor assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for surveyor assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report¹⁰. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro.
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP⁺ cells were sorted at day 3 for T7EI assay. (C) T7EI assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for T7EI assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report¹⁰. Please click here to view a larger version of this figure.