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摘要

本文介绍了一种涉及单核细胞靶向肽 amphiphile 胶束的合成和表征方法, 并对胶束与单核细胞结合的生物相容性和能力进行了相应的测试。

摘要

动脉粥样硬化是心血管疾病的主要贡献者, 是全世界死亡的首要原因, 每年有1730万人丧生。动脉粥样硬化也是导致猝死和心肌梗塞的主要原因, 由不稳定的斑块引起, 破裂并咬合血管, 无预警。目前的成像模式不能区分稳定和不稳定的斑块破裂。多肽分子胶束 (PAMs) 可以克服这一缺点, 因为它们可以修改的各种靶向基, 具体绑定到病变的组织。单核细胞已被证明是动脉粥样硬化的早期标记物, 而单核细胞的大量积累与易破裂的斑块有关。因此, 能够靶向单核细胞的纳米粒子可以被用来鉴别动脉粥样硬化的不同阶段。为此, 在这里, 我们描述了一个协议为单核细胞靶向 PAMs (核细胞趋化蛋白 protein-1 (MCP-1) PAMs) 的制备。MCP-1 PAMs 是通过合成在温和条件下形成纳米颗粒的 15 nm 直径与近中性表面电荷。在体外中, PAMs 被发现具有生物相容性, 对单核细胞具有较高的亲和力. 本文所描述的方法对动脉粥样硬化以及其他炎症性疾病的广泛应用有广阔的前景。

引言

心血管疾病仍然是全球死亡的主要原因, 全世界约有1730万人死亡,1。心血管疾病是由动脉粥样硬化造成的, 一种情况是斑块在动脉中形成, 从而抑制血液和氧气流向身体的细胞2,3。动脉粥样硬化的进展是由炎症反应、不规则脂代谢和斑块堆积引起的动脉增厚和硬化, 导致斑块破裂和心肌梗死4,5。内皮细胞表达细胞因子和黏附分子, 其中包括 MCP-1, 结合到 c-c 趋化因子受体 (CCR2) 的表面发现单核的6,7,8。氧化胆固醇在斑块形成的早期将单核细胞转化为巨噬生物, 从而放大了该地区的炎症反应, 导致组织损伤, 形成不稳定或易受伤害的斑块9,10。

传统上, 动脉粥样硬化是评估腔狭窄的解剖成像使用血管造影或超声11,12。然而, 这些方法只能确定严重的动脉壁狭窄, 而不是动脉粥样硬化的早期阶段, 因为最初的斑块生长导致动脉重塑, 以维持动脉大小和血流率12,13, 14。因此, 造影 underrepresent 动脉粥样硬化的患病率。此外, 非侵入性成像技术, 如单光子发射计算机断层扫描, 正电子发射断层扫描和磁共振成像最近被用来表征斑块形态, 因为它们可以提供初步的细节和斑块的特征。然而, 这些模式往往受限于缺乏灵敏度, 空间分辨率, 或要求使用电离辐射, 使成像斑块进展在不同阶段更具挑战性的15,16, 17。一个成像传递系统, 将专门确定斑块在不同阶段的动脉粥样硬化仍有待开发。

纳米粒子已显示为体内斑块靶和诊断的一个新兴平台18,19,20,21。特别是, PAMs 是有利的, 因为他们的化学多样性和能力, 以适应各种基, 组成, 大小, 形状和表面功能化22。多肽分子 (PAs) 由亲水性, 多肽 "headgroup" 附着在疏水的尾巴上, 通常是脂质;这两亲结构赋予自功能, 并允许在粒子的表面上的多肽的多显示22,23,24。肽 headgroups 可通过折叠和多肽25之间的氢键作用影响颗粒形状。通过β-片相互作用折叠的多肽已经被证明形成拉长的胶束, 而α-螺旋确认可以形成球形和拉长的胶束22,23,24, 25,26,27。聚乙二醇 (PEG) 连接, 屏蔽了肽的表面电荷可以放在亲水性肽和 PAMs 的疏水尾之间, 增强了纳米颗粒在系统循环中的可用性28,29,30,31. PAMs 也很有利, 因为它们具有生物相容性, 并被证明具有广泛的应用范围3233。胶束的水溶性比其他纳米系统的优势, 如某些高分子纳米颗粒, 不溶于水, 必须在增悬浮在注射剂34。此外, 创建 PAMs 的能力, 以响应特定的刺激, 使 PAMs 一个有吸引力的候选人, 控制细胞内药物传递35。

通过结合 CCR2 受体和积累在主动脉弓, PAMs 以前开发的单核细胞靶向监测不同阶段的动脉粥样硬化病变的主动脉9。在载脂蛋白-/-小鼠中, 单核细胞积累成正比地增加到斑块级数36。此外, 发现有易破裂的晚期斑块的患者有较高的单核细胞数量37。因此, 对 PAMs 的修改, 以纳入 MCP-1 是有用的, 因为它允许更大的目标特异性和分化的早期和晚期动脉粥样硬化病变。这些概念验证研究还证实了 PAMs 是足够安全的, 可以使用 pre-clinically 并清除 renally38。由于单核细胞和炎症的特点, 其他疾病, MCP-1 PAMs 有潜力用于治疗和诊断的应用以外的其他疾病的动脉粥样硬化8,39,40,41。

在此, 我们报告了高可伸缩性和自组装 MCP-1 PAMs 的制作, 证明了粒子的最佳大小, 表面电荷, 选择性靶向单核细胞的增强成像应用在动脉粥样硬化。

研究方案

注: 阅读试剂的 MSDS, 并按照当地机构的要求, 遵守所有化学安全措施。

1. MCP-1 PAMs 的制备

  1. MCP-1 肽的制备
    1. 在反应容器 (RV) 中, 称 n-芴甲氧羰基-l-赖氨酸 (Boc)-摩尔0.25。用化学油烟机冲洗5毫升 dimethylforamide (DMF) 的 RV 侧面。
    2. 将 RV 加载到自动台式多肽合成器上。载入预包装的氨基酸瓶, n "-CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS-c", 从 c 到 N 末端。在最后的脱步骤中包括一个空瓶子。
      注意: 一个序列, N "-CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK-C" 的炒多肽, 也可以使用相同的协议合成。
    3. 一旦合成完成, 转移到树脂的多肽从 RV 到闪烁瓶与2-3 毫升甲醇, 直到所有的树脂转移。在树脂沉到底部后, 除去甲醇上清液, 蒸发剩余的直至干燥。真空干燥额外的2小时或隔夜在室温下。
    4. 制作12毫升解理液含 trifluoracetic 酸 (TFA): 乙: 水: triisopropylsilane 在 94:2. 5:2. 5:1% 在化学油烟罩中。旋流的裂解液, 以确保它是均匀混合。
      警告: 由于 triisopropylsilane 和乙是敏, 氩清除库存瓶的 triisopropylsilane 和乙1分钟之前, 把他们回来。
    5. 将合成容器 (sv) 放在靠近 SV 的下半部分的位置上。转移肽树脂到 SV 与2毫升的裂解液, 直到所有的肽树脂转移。
    6. 用3毫升解理液清洗 SV 的两侧。关闭 SV 的盖子, 在300振荡/分钟晃动4小时。
    7. 称量出一个空的50毫升离心管。记录质量。
    8. 4小时后, 将从 SV 的裂解肽溶液排出到50毫升离心管中。用剩余的溶液冲洗几次 SV 。
    9. 蒸发裂解肽溶液与氮气, 直到有少于4毫升剩余在离心管。
    10. 将36毫升的 ice-cold 醚加入到多肽裂解溶液中。
    11. 漩涡的解决方案, 直到它是完全白色或黄色。离心机在 3000 x g 为5分钟在4° c, 和醒酒上清液。
    12. 加入40毫升 ice-cold 醚的管。漩涡和几种再次。重复离心过程。醒酒上清。
    13. 用氮气气体吹干粗 PA 颗粒, 直到醚明显蒸发。
    14. 加入20毫升双水, 漩涡和几种, 直到肽完全溶解在溶液中。
    15. 冷冻溶液, lyophilize 直至干燥。
    16. 一旦该肽被晒干, 称量出含有该粗肽的离心管的质量。将粗肽溶于5毫克/毫升水中。
    17. 在5毫升双水中溶解25毫克的粗 MCP-1 肽, 使总浓度为5毫克/毫升。用高效液相色谱 (HPLC) 纯化 MCP-1 肽, 用 0.1% TFA 水 (溶剂 a) 和 0.1% TFA 在乙腈 (溶剂 B) 中作为流动相在 C8 反相柱上。将5毫升的肽注入 HPLC。
      注: 初始流动阶段由100% 溶剂 a 组成, 流速为9.0 毫升/分钟. 减少溶剂 a 慢慢地到30% 在 27 min 并且举行在这个构成为 3 min. 返回梯度到100% 溶剂 a 在 3 min 并且举行在这个构成为 1 min 给总运行时34分钟保持柱温在55° c。使用正离子源模式进行分析。如果 TFA 对 HPLC 柱的酸性太强, 可用于代替 TFA。建议有机溶剂组成的坡道速度不应超过 2%/分钟, 以便更好地分离。
    18. 用基体辅助激光解吸/电离 (MALDI) 质谱分析每一个分数, 以达到预期产品的2890。
      注: 在乙腈/水 (50:50%) 中, 以1毫克/毫升溶解α-氰基-4-肉桂酸为基体溶液。点0.75 µL 的矩阵解到 MALDI 板上, 其次是0.75 µL 的每个分数。在500-5、000 Da 的质量范围内采用正反射离子模式进行分析。
    19. 结合产品的分数, 吹灭乙腈, 冷冻, 和 lyophilize 纯化多肽直到干燥。
  2. MCP-1 PA 的研制
    1. 准备1.1 摩尔超过 12-硬脂酸-sn-磷脂-3-乙醇-N-[氨基 (聚乙二醇)-2000] DSPE-PEG (2000)-亚在单独的闪烁小瓶中的多肽。溶解在双水中的两个化合物, 使〜15毫克/毫升。几种15分钟或直到两个解决方案都完全清楚。
      注: DSPE peg (2000)-Cy5 是用同一个协议合成的 DSPE peg (2000)-胺和 n-羟基琥珀酰亚氨酸酯官能化 Cy5, 除了步骤 1.2.3, 其中 pH 值的解决方案被调整到8.5。
    2. 添加 DSPE-PEG (2000)-亚溶液的肽溶液。漩涡和几种。
    3. 添加1米氢氧化钠滴 (1 µL) 的时间, 直到溶液的 pH 值是7。
    4. 氮气净化液5分钟搅拌溶液过夜。
    5. 冷冻溶液, lyophilize 直至干燥。
    6. 一旦原油干燥, 溶解固体在5毫克/毫升水。
    7. 用高效液相色谱法纯化。
      注: 游离肽和 DSPE (2000) 应洗在15-30% 有机浓度之间 (%), 而 DSPE-peg (2000)-MCP-1 共轭应在40-50% 有机浓度之间洗。
    8. 用 MALDI 质谱法分析对应的 m/z 的每个分数. DSPE-PEG (2000)-MCP-1 应该有一个宽的 m/z 峰值在5760。
      注:25-苯甲酸酸最适用于 DSPE-PEG (2000)-MCP-1 与 MALDI 的矩阵。
  3. MCP-1 PAMs 的组装
    1. 用3毫升甲醇在 1 dram 瓶中溶解1.75 毫克 MCP-1 PAs。几种直到 MCP-1 PA 完全溶解。
      注: Cy5 分子可并入 10:90 MCP-1 PA 的摩尔比率, 用于成像应用。
    2. 将甲醇在氮气下以圆周运动的形式蒸发, 同时冲洗瓶子一侧的剩余甲醇, 直到瓶底形成均匀的薄膜。真空干燥这部电影过夜。
    3. 用3毫升的水或磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 将薄膜水合成100的 MCP-1 PAMs 的µM 溶液。轻轻的漩涡和几种的解决方案, 直到清除。孵育在80° c 为30分钟。
      注: 升高的温度已显示加速自组装过程, 并允许肽组分形成最稳定的二级结构, 同时降低临界胶束浓度 (CMC)42,43。
    4. 冷却结果分散到室温。

2. MCP-1 PAMs 的表征

  1. 动态光散射 (dl) 和泽塔电位
    1. 根据 dl 或泽塔电位仪的指示, 在试管中放置100µM MCP-1 pam 或炒 pam。
      注: dl 和泽塔电位试管可以根据仪器的指示不同而有所不同。
    2. 将仪器平衡到室温。测量 PAM 的尺寸和表面电荷。
  2. 透射电子显微镜 (TEM)
    1. 添加7µL 50 µM MCP-1 pam 或炒 pam 到一个 TEM 网格悬浮在一个自动关闭的镊子为5分钟灯芯远离的水滴与一个微妙的任务擦拭。
    2. 加7µL 水清洗网格。灯芯远离滴。
    3. 添加7µL 1% 磷钨酸2分钟灯芯远离滴。重复步骤2.2.2。
    4. 在 tem 分析之前, 先将 tem 网格烘干。
  3. 圆形二 (CD) 光谱学
    1. 在使用仪器前, 打开氮气5-10 分钟。
    2. 将300µL 的空白 (水或 PBS) 放在试管。
    3. 测量光谱在190-265 毫微米, 0.2 毫米路径长度以 1 s 集成时间和1毫微米带宽在室温下。收集3复制。
    4. 测量100µM MCP-1 肽, MCP-1 pam, 炒多肽, 并在步骤2.3.3 描述的相同条件下的炒 pam。从空白处减去。
    5. 使用赖氨酸基谱的线性插值来拟合数据。
    6. 关掉仪器在关闭氮气之前等待10分钟。

3.体外MCP-1 PAMs 的分析

  1. 体外生物相容性
    1. 培养和扩展 WEHI 274.1 小鼠单核细胞在 Dulbecco 的改良鹰培养基中补充10% 胎牛血清 (FBS), 1% 青霉素-链霉素, 和0.05 毫米 2-基在37° c 以下 5% CO2到段落5。
      注: WEHI 274.1 是悬浮细胞。当培养时, 媒体应每2-3 天补充一次。
    2. 吸管单核细胞在培养基中变成无菌50毫升离心管。离心机在 300 x g 为5分钟在4° c。
    3. 吸取旧媒体和重在10毫升新鲜媒体进入离心管。慢慢混合, 直到细胞均匀分布在介质中。使用台盼蓝染色和例计数细胞。
    4. 稀释的细胞, 使每90µL 的介质有4000单核。在96孔板的井中加入90µL 的细胞。孵育24小时。
      注意: 避免在板的外边缘使用水井, 以避免在蒸发和板热变化的差异。用100µL PBS 填充外部井。
    5. 将0.15 µmol MCP-1 肽, MCP-1 pam, 炒多肽, 或炒 pam 在150µL PBS 在单独的, 灭菌的离心管中溶解。执行连续稀释, 使每个样品的 1, 10 和100µM 的65µL。
    6. 在含 WEHI 274.1 的油井中加入10µL PBS (总体积: 100 µL, 6 条线, 96 个总井)。孵育72小时。
    7. 每井添加10µL (3-(45-dimethylthiazol-2-基)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-磺)-2 h-唑) (MTS)。孵育1小时。
    8. 使用 490 nm 的平板阅读器或根据制造商的说明分析吸光度。
  2. 体外胶束绑定
    1. 种子50万单核细胞在每6个井板2毫升的培养基中含有100µM Cy5-labeled MCP-1 PAM (10:90 摩尔比 DSPE-PEG (2000)-Cy5 和 MCP-1 PA)。孵育1小时。
    2. 收集 WEHI 274.1 由离心 300 x g 为5分钟在4° c。吸媒体。
    3. 在2毫升 PBS 中重和冲洗细胞。离心机在 300 x g 为5分钟在4° c。吸入 PBS重复洗涤过程与2毫升 PBS。吸入 PBS
    4. 加入2毫升的冷4% 甲醛修复细胞。室温孵育10分钟。
    5. 将固定细胞吸管在一个6孔板的井内的无菌玻璃片上。离心机在 400 x g 为5分钟。
    6. 删除甲醛。用2毫升 PBS 清洗和冲洗一次。重1毫升 PB
      注意: 冲洗时, 避免干扰片上的细胞。
    7. 将10µL 90% 甘油放在 PBS 的一张幻灯片上。用针和镊子拿起片。擦干片的边缘。轻轻地把片放到一张朝下的滑梯上。
    8. 用清晰的指甲油轻轻封住片的边缘。放置在冰箱中, 直到准备好成像。
    9. 使用共焦激光扫描显微镜 (CLSM) 安装与激光器为 Cy5 在λ励磁= 650 nm。

结果

MCP-1 PAM 的制备
MCP-1 蛋白 [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] 或炒多肽 [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] 的 CCR2-binding 母题 (残留 13-35) 通过在 N 端部添加半胱氨酸残留物而改变。采用全自动肽合成器, 用甲氧羰基介导的固相法合成了 MCP-1 肽。用反相高效液相色谱法在50° c 的 C8 柱上用 0.1% TFA 在乙腈/水混合物中纯化了粗肽, 并以 MALDI 质谱 (图 1) 为特征。含半胱氨酸的肽被共轭到 DSPE-PEG2000-maleimide 上, 通过硫链的连接产生 DSPE-PEG (2000)-肽共轭物。在室温24小时后, 用 HPLC (图 2) 对原油进行提纯。DSPE-PEG (2000)-Cy5 是用琥珀酰亚胺酯反应合成的。单核细胞靶向 PAMs co-assembled 与 DSPE peg (2000)-MCP-1 和 DSPE-peg (2000)-Cy5 是由溶解在甲醇, 然后蒸发了 N2, 并产生的薄膜在真空干燥过夜和自组装在水或PBS 通过疏水相互作用的 "尾群" 形成 MCP-1 PAMs。

MCP-1 PAM 的表征
单核靶 PAMs 的 dl 数据和 TEM 图像显示分散, 直径为15.3 ± 2.0 nm 的球形纳米颗粒 (图 3和表 1)。两个 MCP-1 PAMs 和炒 PAMs 显示了轻微的正面泽塔电位12.1 ± 3.1 mv 和13.7 ± 1.9 mv, 分别 (表 1)。CD 显示, MCP-1 肽在胶束中的加入增强了二级结构 (表 2, MCP-1 PAMs: 46.2 ±0.9% β页, 53.1 ±1.4% 随机线圈, 自由 MCP1: 34.2 ±3.5% β页, 65.8 ±3.5% 随机线圈)。

体外MCP-1 PAM 分析
体外MCP-1 PAMs 的生物相容性和单核细胞结合的共聚焦显微镜观察。小鼠单核细胞 MCP-1, MCP-1 pam, 炒多肽, 和炒 pam 的72小时的浓度增加, 并发现其可存活和生物相容性高达100µM (图 4)。此外, 共聚焦显微镜显示单核细胞与 MCP-1 PAMs 的特异结合, 与炒 PAMs (图 5)。

figure-results-1513
图 1:HPLC 在 220 nm (肽键的波长) 和 254 nm (酪氨酸波长) 的 MCP-1 肽 (A) 和炒多肽 (B) (盒装峰值在 7.4 min)。MALDI MCP-1 肽 (C) 和炒多肽 (D) 在500-5、000 Da 的范围内的质量频谱, 显示在 m/z 2888 (预期 2890) 的 [m + H]+的峰值。请单击此处查看此图的较大版本.

figure-results-2065
图 2:HPLC 色谱在 220 nm (肽键的波长) 和 254 nm (酪氨酸波长) 的 DSPE peg (2000)-MCP-1 (A) 和 DSPE-peg (2000)-炒 (B)。(装箱峰值在16.9 分钟)。(C) MALDI-DSPE-PEG (2000)-MCP-1 的质量谱在 100万 Da 的范围内显示了 [M + H] 的峰值+在 m/z 2888 (预期 2890) 为 MCP-1 和 m/z 5758 (预期 5760) 为 DSPE-PEG (2000)-MCP-1。(D) MALDI-DSPE-PEG (2000) 的质量谱--在 100万 Da 的范围内进行炒, 显示 [M + H] 的峰值]+在 m/z 2887 (预计为 2890) 的炒多肽和 m/z 5761 (预期 5760) 为 DSPE-PEG-炒。请单击此处查看此图的较大版本.

figure-results-2819
图 3:MCP-1 pam (A) 和已炒 pam (B) 的 TEM 图像。缩放条形图 = 100 nm。数字-MCP-1 pam (C) 和通过 dl (D) 的已加密 pam 的平均大小分布。数据是平均±法令 (n = 3)。(E) CD 分析 MCP-1 和炒多肽和 PAMs (n = 3)。请单击此处查看此图的较大版本.

figure-results-3357
图 4:体外WEHI 274.1 小鼠单核细胞存活72小时后接触 MCP-1 肽、MCP-1 pam、炒多肽和炒 pam.数据是平均±法令 (n = 6)。请单击此处查看此图的较大版本.

figure-results-3763
图 5:CLSM MCP-1 pam (A) 和被炒的 pam (B) 的图像与10摩尔 Cy5 PA (红色) 一起孵化与 WEHI 274.1 为 1 h. 刻度栏 = 20 µm.请点击这里查看这个数字的更大版本.

pams数字大道直径 (nm)pdi泽塔势 (mV)
MCP-115.3 ±2。00.119 ±0.00612.1 ±3。1
炒16.9 ±1。40.232 ±0.01913.7 ±1。9
在 PBS 缓冲区中测量。数据以平均± SD 表示。

表 1:PAMs 的大小、多和泽塔电位.

a-螺旋 (%)b 页 (%)随机线圈 (%)
MCP-1 肽0.0 ±0。036.2 ±2。263.8 ±1。8
MCP-1 PAM0.7 ±0。646.2 ±0。953.1 ±1。4
炒多肽0.0 ±0。043.7 ±2。156.3 ±3。5
炒 PAM0.0 ±0。060.7 ±0。239.3 ±0。2

表 2:多肽和 PAMs 的二级结构组成.

讨论

MCP-1 PAMs 是一个充满希望的分子成像平台, 包括一个亲水性靶向肽和疏水尾巴, 驱动自组装性质的纳米颗粒。这种单核细胞靶向胶束可以通过简单的合成和纯化步骤 MCP-1 肽和 DSPE-PEG (2000)-MCP-1。PAMs 有许多有益的特征为在体内分子成像, 如他们的自组装在温和的条件下, 内在生物降解性, 和结构和化学多样性允许纳入其他成像基或靶向多肽选择性地传递到特定的感兴趣的地点。它们的粒度、形状和组成可以通过改变肽、疏水尾或胶束浓度来调节, 从而为各种应用提供最佳的化学和物理特性22,33。

应提及本议定书的一些局限性。首先, 由于 PAMs 是由疏水相互作用驱动的, 所以有必要构建具有亲水性的靶向肽, 从而允许在胶束表面呈现靶向基团。如果肽序列是疏水的, 在 C 末端增加一个或两个亲水氨基酸可以容纳, 但氨基酸的加法可能影响多肽二级结构在胶束之内, 因此改变物产肽在它的本机状态在蛋白质44,45中。其次, 在低浓度时, PAMs 在水环境中的稳定性较差, 因为它们高度依赖 CMC, PAs 形成胶束结构所需的最低浓度为46。在 CMC 下面, 胶束分解为单个 PA 单体, 并限制胶束作为载体, 在特定的站点47上卸载药物。为了缓解这个缺点, CMC 可以通过增加疏水尾部的链长48,49来减少。最后, 不推荐 PAMs 在溶液中的长期贮存, 因为 PA 二次结构可以随时间变化, 从而影响胶束结构和稳定性, 以及配体结合的效率26。

总之, 该协议证明了一个健壮的, 自组装肽 micelle-based 纳米的成像动脉粥样硬化的策略。MCP-1 PAMs 是生物相容性的, 可降解的, 无毒的, 因为胶束的成分来自于体内的元素。更重要的是, MCP-1 PAMs 对单核细胞有优先的约束力, 这增加了与斑块进展的比例, 促进了非侵入性的方法来区分动脉粥样硬化斑块的分期。由于该平台的模块化, PAMs 可以纳入治疗, 额外的靶向肽, 成像基, 和核酸。因此, 鉴于这些多功能胶束的动态能力, 我们相信这些粒子对动脉粥样硬化和其他疾病的临床翻译有很大的希望。

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

作者要感谢南加州大学, 国家心脏, 肺和血液研究所 (aha), R00HL124279, Eli 和伊蒂丝广泛创新奖的财政支持, 以及力惠蒂尔基金会非癌症翻译研究奖授予 EJC。作者感谢中心的电子显微镜和微量分析, 卓越中心的 NanoBiophysics, 卓越中心的分子特性, 和翻译成像中心在南加州大学的援助仪器设置。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-ethanedithiolVWRE0032for peptide synthesis
10 mL disposable serological pipetsVWR89130-898for cell culture
15 mL centrifuge tubes, polypropyleneVWR89401-566for various applications
2,5-dihydroxybenzoic acid, 99%Fisher ScientificAC165200050for MALDI
25 mL disposable serological pipetsVWR89130-900for cell culture
2-Mercaptoethanol, 50 mMThermoFisher Scientific31350010for cell culture
5 mL disposable serological pipetsVWR89130-896for cell culture
50 mL centrifuge tubesVWR89039-658for various applications
75 cm2 culture flaskFisher Scientific13-680-65for cell culture
75 mL reaction vesselProtein Technologies3000005for peptide synthesis
96-wells cell culture plateVWR40101-346for MTS assay
Acetonitrile, HPLC gradeFisher ScientificA998SK-4for HPLC purification
Borosilicate glass, 1 dramVWR66011-041for PAM synthesis
Borosillicate glass pipet, Long tipsVWR14673-043for various applications
Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mmFisher Scientific12-542Bfor confocal microscopy
Cy5 amineAbcamab146463for peptide conjugation
Diethyl ether, ACS gradeFisher ScientificE138-1for peptide precipitation
Disposable syringes, 20 mLFisher Scientific14-817-54for HPLC purification
Double neubauer ruled hemocytometerVWR63510-13for cell counting
DSPE-PEG(2000) amineAvanti880128Pfor peptide conjugation
DSPE-PEG(2000) maleimideAvanti880126Pfor peptide conjugation
DSPE-PEG(2000)-NHS ester NanocsPG2-DSNS-10Kfor conjugation to Cy5
Dulbecco's modified eagle medium-high glucoseSigma AldrichD5796-500MLfor cell culture
Fetal bovine serum, qualified, heat inactivatedThermoFisher Scientific10438026for cell culture
Fmoc-L-Ala-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Afor peptide synthesis
Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-RBFfor peptide synthesis
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-NTfor peptide synthesis
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-CTfor peptide synthesis
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-QTfor peptide synthesis
Fmoc-L-Ile-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Ifor peptide synthesis
Fmoc-L-Leu-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Lfor peptide synthesis
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-KBCfor peptide synthesis
Fmoc-L-Phe-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Ffor peptide synthesis
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-SBfor peptide synthesis
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-TBfor peptide synthesis
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-YBfor peptide synthesis
Fmoc-L-Val-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Vfor peptide synthesis
Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 meshNovabiochem856013for peptide synthesis
Formic acid, optima LC/MS gradeFisher ScientificA117-50for HPLC purification
GlycerolVWRM152-1Lfor confocal microscopy
Hand tally counterFisher ScientificS90189for cell counting
Magnetic stir bars, egg-shapedVWR58949-006for peptide conjugation
Methanol, ACS certifiedFisher ScientificA412-4for PAM synthesis
MTS cell proliferation colorimetric assay kitVWR10191-104for MTS assay
N,N-Dimethylformamide, sequencing gradeFisher ScientificBP1160-4for peptide synthesis
N-MethylmorpholineProtein TechnologiesS-1L-NMMfor peptide synthesis
ParaformaldehydeFisher ScientificAC416780250for fixing cells
PBS, pH 7.4ThermoFisher Scientific10010049for various applications
Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mLThermoFisher Scientific15140122for cell culture
Peptide synthesis vessel, 25 mL Fisher ScientificCG186011for peptide synthesis
Phosphotungstic acid Fisher ScientificA248-25for TEM
PiperidineSpectrumP1146-2.5LTGLfor peptide synthesis
Plain glass microscope slide 75 x 25 mmFisher Scientific12-550-A3for confocal microscopy
Reagent reservoirs, sterile VWR95128093for cell culture
Self-closing tweezerTedPella515for TEM
TEM support filmTedPella01814Ffor TEM
Trifluoroacetic acid Fisher ScientificBP618-500for peptide cleavage and HPLC purification
TriisopropylsilaneVWRTCT1533-5mlfor peptide cleavage
Trypan blue solution, 0.4%ThermoFisher Scientific15250061for cell counting
Tweezer, general purpose-serratedVWR231-SA-SEfor confocal microscopy
WEHI-274.1ATCCATCC CRL-1679murine monocyte
automated benchtop peptide synthesizerProtein TechnologiesPS3 Benchtop Peptide Synthesizer
α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99%Sigma Aldrich476870-2Gfor MALDI

参考文献

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e60 (2016).
  2. Falk, E. Pathogenesis of atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (8, Suppl. C), C7-C12 (2006).
  3. Rahmani, M., Cruz, R. P., Granville, D. J., McManus, B. M. Allograft Vasculopathy Versus Atherosclerosis. Circ. Res. 99 (8), 801-815 (2006).
  4. Luis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
  5. Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature (London, U. K). 473 (7347), 317-325 (2011).
  6. Boring, L., Gosling, J., Cleary, M., Charo, I. F. Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis. Nature (London). 394 (6696), 894-897 (1998).
  7. Szmitko, P. E., et al. New Markers of Inflammation and Endothelial Cell Activation. Circulation. 108 (16), 1917-1923 (2003).
  8. Deshmane, S. L., Kremlev, S., Amini, S., Sawaya, B. E. Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. J. Interferon Cytokine Res. 29 (6), 313-326 (2009).
  9. Chung, E. J., et al. Monocyte-Targeting Supramolecular Micellar Assemblies: A Molecular Diagnostic Tool for Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (3), 367-376 (2015).
  10. Chung, E. J. Targeting and therapeutic peptides in nanomedicine for atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 891-898 (2016).
  11. Sanz, J., Fayad, Z. A. Imaging of atherosclerotic cardiovascular disease. Nature (London, U. K.). 451 (7181), 953-957 (2008).
  12. Tarkin, J. M., et al. Imaging Atherosclerosis. Circ. Res. 118 (4), 750-769 (2016).
  13. Hennerici, M., Baezner, H., Daffertshofer, M. Ultrasound and arterial wall disease. Cerebrovasc Dis. 17 Suppl 1, 19-33 (2004).
  14. Nissen, S. E. Application of intravascular ultrasound to characterize coronary artery disease and assess the progression or regression of atherosclerosis. Am J Cardiol. 89 (4A), 24B-31B (2002).
  15. Khalil, M. M., Tremoleda, J. L., Bayomy, T. B., Gsell, W. Molecular SPECT Imaging: An Overview. Int J Mol Imaging. 2011, 796025(2011).
  16. Lerakis, S., et al. Imaging of the vulnerable plaque: noninvasive and invasive techniques. Am J Med Sci. 336 (4), 342-348 (2008).
  17. Sun, Z. H., Rashmizal, H., Xu, L. Molecular imaging of plaques in coronary arteries with PET and SPECT. J Geriatr Cardiol. 11 (3), 259-273 (2014).
  18. Godin, B., et al. Emerging applications of nanomedicine for the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases. Trends Pharmacol. Sci. 31 (5), 199-205 (2010).
  19. Branco de Barros, A. L., Tsourkas, A., Saboury, B., Cardoso, V. N., Alavi, A. Emerging role of radiolabeled nanoparticles as an effective diagnostic technique. EJNMMI Res. 2 (1), 31-39 (2012).
  20. Jayagopal, A., Linton, M. F., Fazio, S., Haselton, F. R. Insights into atherosclerosis using nanotechnology. Curr. Atheroscler. Rep. 12 (3), 209-215 (2010).
  21. Khodabandehlou, K., Masehi-Lano, J. J., Poon, C., Wang, J., Chung, E. J. Targeting cell adhesion molecules with nanoparticles using in vivo and flow-based in vitro models of atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 242 (8), 799-812 (2017).
  22. Trent, A., Marullo, R., Lin, B., Black, M., Tirrell, M. Structural properties of soluble peptide amphiphile micelles. Soft Matter. 7 (20), 9572-9582 (2011).
  23. Hartgerink, J. D., Beniash, E., Stupp, S. I. Peptide-amphiphile nanofibers: A versatile scaffold for the preparation of self-assembling materials. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (8), 5133-5138 (2002).
  24. Missirlis, D., et al. Effect of the Peptide Secondary Structure on the Peptide Amphiphile Supramolecular Structure and Interactions. Langmuir. 27 (10), 6163-6170 (2011).
  25. Zhong, L., Johnson, W. C. Environment affects amino acid preference for secondary structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (10), 4462-4465 (1992).
  26. Shimada, T., Lee, S., Bates, F. S., Hotta, A., Tirrell, M. Wormlike Micelle Formation in Peptide-Lipid Conjugates Driven by Secondary Structure Transformation of the Headgroups. J. Phys. Chem. B. 113 (42), 13711-13714 (2009).
  27. Missirlis, D., et al. Linker Chemistry Determines Secondary Structure of p5314-29 in Peptide Amphiphile Micelles. Bioconjugate Chem. 21 (3), 465-475 (2010).
  28. Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu. Rev. Mater. Sci. 26, 365-394 (1996).
  29. Xue, Y., O'Mara, M. L., Surawski, P. P. T., Trau, M., Mark, A. E. Effect of Poly(ethylene glycol) (PEG) Spacers on the Conformational Properties of Small Peptides: A Molecular Dynamics Study. Langmuir. 27 (1), 296-303 (2011).
  30. Canalle, L. A., Loewik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Polypeptide-polymer bioconjugates. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 329-353 (2010).
  31. Hamley, I. W. PEG-Peptide Conjugates. Biomacromolecules. 15 (5), 1543-1559 (2014).
  32. Acar, H., et al. Self-assembling peptide-based building blocks in medical applications. Adv. Drug Delivery Rev. , (2016).
  33. Busseron, E., Ruff, Y., Moulin, E., Giuseppone, N. Supramolecular self-assemblies as functional nanomaterials. Nanoscale. 5 (16), 7098-7140 (2013).
  34. Barrett, J. C., et al. Modular Peptide Amphiphile Micelles Improving an Antibody-Mediated Immune Response to Group A Streptococcus. ACS Biomater. Sci. Eng. 3 (2), 144-152 (2017).
  35. Toughrai, S., et al. Reduction-Sensitive Amphiphilic Triblock Copolymers Self-Assemble Into Stimuli-Responsive Micelles for Drug Delivery. Macromol. Biosci. 15 (4), 481-489 (2015).
  36. Swirski, F. K., et al. Monocyte accumulation in mouse atherogenesis is progressive and proportional to extent of disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (27), 10340-10345 (2006).
  37. Kashiwagi, M., et al. Association of monocyte subsets with vulnerability characteristics of coronary plaques as assessed by 64-slice multidetector computed tomography in patients with stable angina pectoris. Atherosclerosis (Amsterdam, Neth). 212 (1), 171-176 (2010).
  38. Chung, E. J., Tirrell, M. Recent Advances in Targeted, Self-Assembling Nanoparticles to Address Vascular Damage Due to Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (16), 2408-2422 (2015).
  39. Cassetta, L., Pollard, J. W. Cancer immunosurveillance: role of patrolling monocytes. Cell Res. 26 (1), 3-4 (2016).
  40. Williams, C. B., Yeh, E. S., Soloff, A. C. Tumor-associated macrophages: unwitting accomplices in breast cancer malignancy. NPJ Breast Cancer. 2, (2016).
  41. Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and Macrophages in Cancer: Development and Functions. Cancer Microenviron. 6 (2), 179-191 (2013).
  42. Schick, M. J. Effect of temperature on the critical micelle concentration of nonionic detergents. Thermodynamics of micelle formation. J. Phys. Chem. 67 (9), 1796-1799 (1963).
  43. Marullo, R., Kastantin, M., Drews, L. B., Tirrell, M. Peptide contour length determines equilibrium secondary structure in protein-analogous micelles. Biopolymers. 99 (9), 573-581 (2013).
  44. Hilbich, C., Kisters-Woike, B., Reed, J., Masters, C. L., Beyreuther, K. Substitutions of hydrophobic amino acids reduce the amyloidogenicity of Alzheimer's disease βA4 peptides. J. Mol. Biol. 228 (2), 460-473 (1992).
  45. Trevino, S. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. Amino Acid Contribution to Protein Solubility: Asp, Glu, and Ser Contribute more Favorably than the other Hydrophilic Amino Acids in RNase Sa. J. Mol. Biol. 366 (2), 449-460 (2007).
  46. Kim, S. W., Shi, Y. Z., Kim, J. Y., Park, K. N., Cheng, J. X. Overcoming the barriers in micellar drug delivery: Loading efficiency, in vivo stability, and micelle-cell interaction. Expert Opin Drug Delivery. 7 (1), 49-62 (2010).
  47. Rangel-Yagui, C. O., Pessoa, A. Jr, Tavares, L. C. Micellar solubilization of drugs. J. Pharm. Pharm. Sci. 8 (2), 147-163 (2005).
  48. Batrakova, E., et al. Fundamental relationships between the composition of pluronic block copolymers and their hypersensitization effect in MDR cancer cells. Pharm. Res. 16 (9), 1373-1379 (1999).
  49. Chen, L. J., Lin, S. Y., Huang, C. C. Effect of Hydrophobic Chain Length of Surfactants on Enthalpy-Entropy Compensation of Micellization. J. Phys. Chem. B. 102 (22), 4350-4356 (1998).

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